Experimental model of systemic inflammation during acetaminophen toxicity

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Acetaminophen is one of the most toxic drugs that can cause liver damage. At the same time, acetaminophen-induced liver failure is closely associated with the development of systemic inflammatory response syndrome. However, there is no drug aimed at suppressing the systemic inflammatory response. That is, this issue needs to be studied experimentally, but a model of systemic inflammation during acetaminophen overdose has not yet been obtained. Therefore, it was decided to develop an experimental model of systemic inflammation during acetaminophen overdose. The purpose of this study was to experimentally substantiate the semi-lethal dose for acetaminophen overdose in C57Bl/6 mice and to evaluate the readings of blood tests after administration of the drug. To determine the semi-lethal dose, male C57Bl/6 mice were intraperitoneally injected with “Ifimol” (Unique Pharmaceutical Laboratories, India) or acetaminophen solution (Sigma-Aldrich, USA) with a concentration of 14 mg/ml in different doses. When introducing “Ifimol”, it was not possible to achieve a semi-lethal dose. When administering a solution of acetaminophen, 50% mortality was recorded at a dose of 600 mg/kg body weight. After establishing a semi-lethal dose, the experimental group was administered an acetaminophen solution (Sigma-Aldrich, USA) with a concentration of 14 mg/ml at a dose of 600 mg/kg. The control group was injected with saline in an equivalent volume. On the second day, liver and peripheral blood samples were taken. Subsequently, hematological and biochemical blood tests and histological analysis were performed. Histological examination revealed centrilobular necrosis and disorganization of the liver structure. According to the biochemical blood test, the activity of aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, creatinine concentration, and the de Ritis coefficient differed statistically significantly (p < 0.05) in the experimental group compared to the control group. Among the hematological blood test parameters, there were statistically significant differences in the number of leukocytes, platelets, as well as the absolute and relative content of granulocytes and lymphocytes. Thus, 48 hours after administration of a semi-lethal dose of acetaminophen, there were signs of damage to internal organs (liver, kidneys) and changes in immune system parameters, which are similar to components of systemic inflammation in humans.

Full Text

Введение

Ацетаминофен (парацетамол, N-ацетил-пара-аминофенол) – нестероидное противовоспалительное средство, один из наиболее широко используемых анальгезирующих и антипиретических препаратов в мировой клинической практике. Острое токсическое повреждение печени ацетаминофеном относится к числу актуальных клинических проблем, а также широко используется в экспериментальной токсикологической практике.

Ацетаминофен-индуцированная острая печеночная недостаточность у пациентов тесно связана с развитием синдрома системной воспалительной реакции (ССВО) и последующим каскадом осложнений, включая печеночную энцефалопатию (ПЭ), коагулопатию и синдром полиорганной дисфункции. В работе Craig и соавт. [2] показано, что развитие системного воспалительного ответа, на фоне индуцированной ацетаминофеном гепатотоксичности, было связано с наиболее неблагоприятным исходом, независимо от наличия инфекции.

В лаборатории иммунологии воспаления ИИФ УрО РАН под руководством Гусева Е.Ю. и Черешнева В.А. многие годы ведутся работы по изучению системного воспаления как типового патологического процесса на основании большого клинического материала. Разработаны шкалы для верификации острого и хронического вариантов системного воспаления в клинической практике [14]. Однако среди изучаемых нозологий не было групп пациентов с отравлениями (сложность взаимодействия с токсикологическими центрами), поэтому было принято решение разработать экспериментальную модель системного воспаления при отравлении ацетаминофеном на экспериментальных животных. Интоксикация ацетаминофеном у мышей может рассматриваться в качестве потенциально перспективной модели системного воспаления (наличие повреждений в сердечно-сосудистой [8], центральной нервной [10, 11, 12], мочеполовой системах [1]).

Цель исследования – экспериментально обосновать LD-50 (lethal dose, 50%) для дальнейшего изучения наличия системного воспаления при отравлении ацетаминофеном у мышей линии C57Bl/6, оценить показания общего и биохимического анализов крови после введения ацетаминофена.

Материалы и методы

В исследовании использовались мыши-самцы линии C57Bl/6 в возрасте 10 недель. Эксперимент проводился в виварии ИИФ УрО РАН при строгом соблюдении требований по уходу и содержанию животных, а также выводу их из эксперимента с последующей утилизацией в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS № 123 от 18.03.1986, Страсбург), Рекомендациями Европейской Комиссии 2007/526/EC от 18 июня 2007 года, Директивой 2010/63/EU европейского парламента и совета европейского союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях. Организация исследования одобрена этическим комитетом ФГБУН ИИФ УрО РАН, протокол № 04/22 от 18 ноября 2022 г.

Для определения полулетальной дозы экспериментальным животным внутрибрюшинно вводили «Ифимол» (Unique Pharmaceutical Laboratories, Индия) или раствор ацетаминофена (Sigma-Aldrich, США) с концентрацией 14 мг/ мл после 12-часового голодания. При этом для «Ифимола» вводимые дозы составили – 500 мг/ кг, 600 мг/ кг, 750 мг/ кг, 1000 мг/ кг массы тела, а для раствора ацетаминофена в концентрации 14 мг/мл – 500, 600, 750 мг/кг массы тела.

В дальнейшей экспериментальной группе животных вводили раствор ацетаминофена (Sigma-Aldrich, США) с концентрацией 14 мг/мл в полулетальной дозе после 12-часового голодания. Контрольной группе вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. На вторые сутки у выживших мышей проводили забор образцов печени и периферической крови из бедренной артерии.

В дальнейшем был проведен гематологический и биохимический анализы крови, гистологический анализ с оценкой общей патоморфологической картины срезов. Анализ периферической крови проведен на автоматизированном гематологическом анализаторе Mindray BC-2800Vet (Mindray, Китай). Статистическая обработка полученных данных проводилась при помощи программного обеспечения Statistica 10 (StatSoft Inc., США).

Результаты и обсуждение

В ответ на введение «Ифимола» в дозе 750 мг/ кг к 14 суткам у мышей отмечалась 50% летальность; в дозе 500 мг/кг – 12,5% летальность; дозировки 400 мг/ кг, 650 мг/ кг, 1000 мг/ кг не вызывали гибели животных. Гибель животных при этом происходила на 6 или 7 сутки после введения препарата.

При внутрибрюшинном введении раствора, полученного путем разведения ацетаминофена в физиологическом растворе в концентрации 14 мг/мл, доза 500 мг/кг не вызывала гибели животных. Доза в 750 мг/кг вызывала 66%-ную летальность. 50%-ная летальность отмечалась при введении дозы 600 мг/кг массы тела. Гибель животных в этих условиях была зафиксирована в первые 12, 24, 48 часов после введения препарата.

По данным исследований, представленных в литературе, полулетальная доза ацетаминофена для мышей составляет 338 мг/кг [7], 500 мг/ кг [3] при внутрибрюшинном способе введения препарата. В нашем исследовании при введении «Ифимола» (раствора ацетаминофена для инфузий, применимого в клинической практике в Российской Федерации) внутрибрюшинно экспериментальным животным в дозах 400 мг/ кг и 500 мг/ кг массы тела выхода на LD-50 достичь не удалось. При этом, несмотря на то, что доза в 750 мг/ кг вызывала 50%-ную летальность, дозировка в 1000 мг/кг не вызвала гибели животных в течение 14 суток. Поэтому было принято решение перейти на использование ацетаминофена фирмы «Sigma-Aldrich», при введении которого полулетальная доза составила 600 мг/кг массы тела.

На основании полученных данных была разработана экспериментальная модель для изучения наличия системного воспаления у мышей линии C57Bl/6 при передозировке ацетаминофеном. Экспериментальным группам мышей линии C57Bl/6 вводился раствор ацетаминофена (14 мг/ мл) в дозе 600 мг/кг массы тела. Контрольным группам животных вводился физиологический раствор в эквивалентном объеме.

При проведении гистологического исследования срезов печени животных, выведенных из эксперимента через 48 часов, с окраской гематоксилин/эозин были выявлены очаговые некрозы в центролобулярных областях, повышение ядерного полиморфизма гепатоцитов, дезорганизация структуры печени, что соотносится с литературными данными [4, 5, 8, 9, 13].

По данным биохимического анализа крови статистически достоверно различались активность аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, значение коэффициента де Ритиса (AST/ALT) по сравнению с контрольной (см. табл. 1). При этом отмечалось снижение значения данного коэффициента. Изменение данных показателей указывает на наличие повреждения клеток печени и нарушение ее нормального функционирования.

 

ТАБЛИЦА 1. Описательная статистика исследуемых показателей в группах экспериментальных животных, Me (Q0,25-Q0,75)

TABLE 1. Descriptive statistics of the indicators studied in the groups of experimental animals, Me (Q0.25-Q0.75)

Группы (№)

Groups (No.)

Показатели

Parameters

Контрольная (№ 1)

Control (No. 1)

n = 7

Экспериментальная (№ 2)

Experimental (No. 2)

n = 7

ALT, мкмоль/мин × л

ALT, µmol/min × L

17,00

(11,00-20,00)2

81,90

(63,50-89,40)1

AST, мкмоль/мин × л

AST, µmol/min × L

12,60

(10,30-16,40)2

131,50

(130,50-137,70)1

AST/ALT, у. е.

AST/ALT, c. u.

1,19

(1,07-1,23)2

0,59

(0,49-0,66)1

Амилаза, мг/с × л

Amylase, mg/s × L

27,00

(25,40-32,50)

28,40

(20,50-37,40)

Креатинин, мкмоль/л

Creatinine, µmol/L

55,60

(54,40-78,20)2

88,50

(79,10-102,80)1

Лейкоциты, 109/л

Leukocytes, 109/L

2,40

(2,00-4,90)2

2,10

(1,50-3,20)1

Лимфоциты, 109/л

Lymphocytes, 109/L

1,90

(1,50-3,10)2

0,65

(0,50-1,30)1

Моноциты, 109/л

Monocytes, 109/L

0,00

(0,00-0,10)

0,00

(0,00-0,10)1

Гранулоциты, 109/л

Granulocytes, 109/L

0,70

(0,40-1,10)2

1,60

(1,20-1,90)1

Лимфоциты, %

Lymphocytes, %

74,00

(65,50-77,60)2

32,15

(27,90-36,80)1

Моноциты, %

Monocytes, %

2,50

(1,30-3,30)

1,90

(1,80-2,70)

Гранулоциты, %

Granulocytes, %

24,70

(19,90-31,00)2

65,15

(61,40-70,30)1

Эритроциты, 1012/л

Red blood cells, 1012/L

9,43

(8,74-10,53)

9,45

(7,01-13,14)

Тромбоциты, 109/л

Platelets, 109/L

1374,00

(1152,00-1427,00)2

374,00

(96,00-420,00)1

Примечание. 1 – статистически значимые отличия (U-критерий Манна–Уитни, p < 0,05) от группы № 1, 2 – статистически значимые отличия (U-критерий Манна–Уитни, p < 0,05) от группы № 2.

Note. 1, statistically significant differences (Mann–Whitney (U) test, p < 0.05) with group No. 1 2, statistically significant differences (Mann–Whitney (U) test, p < 0.05) with group No. 2.

 

Также статистически значимо различалась концентрация креатинина у экспериментальной группы по сравнению с контрольной, что может говорить о развитии к 48 часам после введения препарата повреждения почек.

Среди показателей гематологического анализа крови статистически значимые различия были по количеству лейкоцитов, тромбоцитов, а также абсолютному и относительному содержанию гранулоцитов и лимфоцитов.

Изменения данных показателей указывают на активацию иммунной системы и реакцию системы микротромбообразования.

Таким образом, через 48 часов после введения экспериментальным животным полулетальной дозы ацетаминофена отмечались признаки повреждения внутренних органов (печень, почки), изменения показателей иммунной системы, что аналогично компонентам системного воспаления у людей. Поэтому исследование показателей крови и изменений внутренних органах экспериментальных животных требует дальнейшего изучения.

Выводы

  1. LD-50 для внутрибрюшинного введения ацетаминофена у самцов мышей линии C57Bl/6 составляет 600 мг/кг, что существенно выше дозировок, указанных в литературных источниках.
  2. Через 48 часов после введения LD-50 экспериментальным животным статистически значимо различались активность аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, значения коэффициента де Ритиса, креатинина, лейкоцитов, тромбоцитов, а также абсолютное и относительное содержание гранулоцитов и лимфоцитов.
×

About the authors

A. I. Zudova

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: tina.zudova@mail.ru

Junior Research Associate, Laboratory of Inflammation Immunology

Russian Federation, Yekaterinburg

E. A. Mukhlynina

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: tina.zudova@mail.ru

PhD, MD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Morphology and Biochemistry

Russian Federation, Yekaterinburg

L. V. Solomatina

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: tina.zudova@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Senior Research Associate, Laboratory of Inflammation Immunology

Russian Federation, Yekaterinburg

References

  1. Горшков А.Н., Марусов И.В., Ягмуров О.Д., Игнатов Ю.Д., Кузнецова Н.А., Петрова Ю.А. Морфологические аспекты нефротоксического действия нестероидных противовоспалительных средств // Нефрология, 2013. Т. 17, № 1. С. 73-77. [Gorshkov A.N., Marusov I.V., Yagmurov O.D., Ignatov Yu.D., Kuznetsova N.A., Petrova Yu.A. Morphologic acpects of nonsteroidal antiflammatory drugs nephrotoxic effect. Nefrologiya = Nephrology, 2013, Vol. 17, no. 1, pp. 73-77. (In Russ)].
  2. Craig D.G.N., Reid T.W.D.J., Martin K.G., Davidson J.S., Hayes P.C., Simpson K.J. The systemic inflammatory response syndrome and sequential organ failure assessment scores are effective triage markers following paracetamol (acetaminophen) overdose. Aliment. Pharmacol. Ther., 2011, Vol. 34, no. 2, pp. 219-228.
  3. Dahlin D.C., Nelson S.D. Synthesis, decomposition kinetics, and preliminary toxicological studies of pure N-acetyl-p-benzoquinone imine, a proposed toxic metabolite of acetaminophen. J. Med. Chem., 1982, Vol. 25, no. 8, pp. 885-886.
  4. Gosselin M., Daze Y., Mireault P., Crahes M. Toxic myocarditis caused by acetaminophen in a multidrug overdose. Am.J. Forensic Med. Pathol., 2017, Vol. 38, no. 4, pp. 349-352.
  5. Guo H., Sun J., Li D., Hu Y., Yu X., Hua H., Jing X., Chen F., Jia Z., Xu J. Shikonin attenuates acetaminophen-induced acute liver injury via inhibition of oxidative stress and inflammation. Biomed. Pharmacother., 2019, Vol. 112, 108704. doi: 10.1016/j.biopha.2019.108704.
  6. Krenkel O., Mossanen J.C., Tacke F. Immune mechanisms in acetaminophen-induced acute liver failure. Hepatobiliary Surg. Nutr., 2014, Vol. 3, no. 6, pp. 331-343.
  7. Lewis R.J. SAX’s dangerous properties of industrial materials. J. Hazard. Mater., 2005, Vol. 119, no. 1-3, pp. 258-258.
  8. Lim A.Y., Segarra I., Chakravarthi S., Akram S., Judson J.P. Histopathology and biochemistry analysis of the interaction between sunitinib and paracetamol in mice. BMC Pharmacol., 2010, Vol. 10, pp. 1-17.
  9. Neff S.B., Neff T.A., Kunkel S.L., Hogaboam C.M. Alterations in cytokine/chemokine expression during organ-to-organ communication established via acetaminophen-induced toxicity. Exp. Mol. Pathol., 2003, Vol. 75, no. 3, pp. 187-193.
  10. Philippot G., Hallgren S., Gordh T., Fredriksson A., Fredriksson R., Viberg H. A cannabinoid receptor type 1 (CB1R) agonist enhances the developmental neurotoxicity of acetaminophen (Paracetamol). Toxicol. Sci., 2018, Vol. 166, no. 1, pp. 203-212.
  11. Philippot G., Gordh T., Fredriksson A., Viberg H. Adult neurobehavioral alterations in male and female mice following developmental exposure to paracetamol (acetaminophen): characterization of a critical period. J. Appl. Toxicol., 2017, Vol. 37, no. 10, pp. 1174-1181.
  12. Viberg H., Eriksson P., Gordh T., Fredriksson A. Paracetamol (acetaminophen) administration during neonatal brain development affects cognitive function and alters its analgesic and anxiolytic response in adult male mice. Toxicol. Sci., 2014, Vol. 138, no. 1, pp. 139-147.
  13. Xiao Q., Zhao Y., Ma L., Piao R. Orientin reverses acetaminophen-induced acute liver failure by inhibiting oxidative stress and mitochondrial dysfunction. J. Pharmacol. Sci., 2022, Vol. 149, no. 1, pp. 11-19.
  14. Zotova N., Zhuravleva Y., Chereshnev V., Gusev E. Acute and chronic systemic inflammation: features and differences in the pathogenesis, and integral criteria for verification and differentiation. Int. J. Mol. Sci., 2023, Vol. 24, no. 2, 1144. doi: 10.3390/ijms24021144.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2024 Zudova A.I., Mukhlynina E.A., Solomatina L.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies