Modeling the processes of transendothelial transport of LDL and macrophage migration

Full Text

Введение

Атеросклероз представляет собой хроническое иммуновоспалительное заболевание средних и крупных артерий. Атеросклероз можно рассматривать как многофакторный процесс, включающий различные патологические механизмы, такие как воспаление, модификация липопротеинов, накопление холестерина, дисфункция эндотелия, окислительный стресс и, в конечном счете, образование атеросклеротической бляшки. Основными участниками развития данного заболевания являются эндотелиальные клетки, лейкоциты и гладкомышечные клетки интимы. В результате атеросклеротического изменения стенки сосудов утрачивают эластичность, атеросклеротические бляшки постепенно увеличиваются и закрывают просвет сосуда, что ведет к нарушению кровоснабжения внутренних органов. Огромное количество исследований к настоящему моменту не может в полной мере дать ответ на вопрос о начале развития атеросклеротического поражения. В России атеросклерозом страдает до 30% взрослого населения в возрасте до 45 лет, и до 80% в возрасте после 60 лет [8, 10, 12].

Эндотелий – тонкий слой клеток (ЭК), выстилающий внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, является важным связующим звеном между кровью и всеми тканями. Эндотелий взрослого человека содержит гетерогенные клетки, включая типичные ЭК (около 100 мкм в диаметре) (ТЭК) и гигантские многоядерные варианты ЭК (МВЭК) (свыше 200 мкм в диаметре). Процесс пропускания молекул называется трансэндотелиальным транспортом (ТЭТ). За счет сети межклеточных контактов достигается избирательность пропускания веществ и клеток в интиму сосуда [7].

Эндотелиальную дисфункуцию (ЭД) рассматривают как один из первых этапов атерогенеза. Развитие ЭД сопровождается активной секрецией ЭК молекул адгезии, цитокинов и хемокинов, привлекающих моноциты в очаг поражения, где они дифференцируются в макрофаги поглощают липопротеиды и накапливаются в субэндотелиальном слое [8]. В этом контексте также следует отметить, что в крови пациентов, страдающих атеросклерозом, моноциты предактивированы и обладают некоторыми чертами макрофагов – их адгезия к эндотелию в 1,5 раза выше, чем у здоровых людей [1].

Материалы и методы

Использовали эндотелиоциты человека линии EA.hy926 подтвержденным эндотелиальным фенотипом (наличием основного маркера эндотелия фактора фон Виллебранда) (ATCC, США). Для получения МВЭК монослой эндотелиальных клеток (EA.hy 926) обрабатывали 50%-ным раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000 (НПП «ПанЭко», Россия).

Исследование проводили в 2-камерной системе, верхная камера (ВК) которой представляет собой пористую вставку (трансвелл) с диаметром пор 0,4 для оценки скорости ТЭТ и 3,0 мкм для оценки скорости миграции макрофагов (BIOFIL, Китай), а нижняя камера (НК) – лунку 24-луночного планшета (Sarstedt, Германия), в которой расположена указанная вставка. Поверхность трансвеллы засевали клетками, в количестве 10⁵. Клетки культивировали в среде DMEM (НПП «ПанЭко», Россия) c 10% Fetal bovine serum (FBS) (Biosera, Южная Америка) при 37 °С и 5% СО₂ в течение 2-3 суток до формирования визуального монослоя. Затем в ВК добавляли по 500 мкл среды DMEM, содержащей 100 мкг/мл выделенных ЛПНП человека (обозначали как ВК (О)), для оценки скорости ТЭТ, или 10⁵ макрофагов для оценки скорости миграции. Через 2, 5 и 24 часа проводили измерение оцениваемых параметров.

ЛПНП выделяли из сыворотки крови человека в соответствии с ранее описанным протоколом [3].

Определение концентрации холестерина в среде из лунок и вставок, а также в клетках после экстракции проводили ферментативным колориметрическим методом с использованием коммерческого набора CHOLESTEROL liquicolor (HUMAN, Германия) по модифицированной методике Фолча [2]. Содержание холестерина корректировали по общему уровню белка в лунке, измеренному методом Лоури [4]. Скорость трансэндотелиального транспорта (ТЭТ) определяли как изменение концентрации холестерина в среде, отобранной из НК.

Моноциты CD14⁺ получали из образцов цельной крови стандартным методом выделения лейкоцитарной фракции в градиенте фиколла с последующей магнитной сепарацией с использованием наночастиц (Miltenyi Biotec, США) в соответствии с протоколом производителя. Протокол исследования был одобрен Локальным этическим комитетом РНЦХ им. Б.В. Петровского (протокол № 5 от 11 декабря 2022 г.). Далее моноциты инкубировали в среде с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) (незрелые макрофаги) и/или с липополисахаридом (ЛПС) (GM-CSF+ЛПС) из Escherichia coli серотипа 026:В6 (Sigma-Aldrich, Израиль) в концентрации 1 мкг/мл для дифференцировки в макрофаги М1. После чего добавляли в ВК в количестве 10⁵ клеток.

Измеряли количество мигрировавших клеток в НК через 2, 5 и 24 часа.

Статистический анализ полученных данных был проведен с использованием языка программирования Python и пакетов scipy, numpy, pandas, а также matplotlib, seaborn для визуализации результатов. В работе были использованы критерий Фишера с поправкой Данна для множественных сравнений, U-критерий Манна–Уитни с поправкой Бонферони, а также критерий Краскела–Уоллиса с апостериорным тестом Коновера. Для описания результатов использовали медианное значение, а также 25-й и 75-й процентили. Нормирование показателя накопления холестерина в НК и ВК проводили по среднему значению контроля, а для сравнения показателя соотношения холестерина к общему белку на 5×10⁵ клеток использовали нормирование по минимальному и максимальному значению в эксперименте, которое приводит значения признака к диапазону от 0 до 1.

Результаты и обсуждение

Ранее исследователями было обнаружено, что МВЭК аккумулируют холестерин активнее, чем ТЭК [5, 9], однако никто до настоящего времени не оценивал ТЭТ и миграцию макрофагов через эндотелиальный барьер, состоящий из преимущественно многоядерных клеток.

Мы не увидели статистически значимой разницы через 2 и 5 часов, различия были найдены только спустя 24 часа измерений, причем содержание холестерина в НК для ТЭК спустя 24 часа выросло в 1,43 раза (p < 0,05), а для МВЭК – в 1,83 раза (p < 0,05). Статистических различий в скорости ТЭТ между ТЭК и МВЭК найдено не было (табл. 1).

 

Таблица 1. Нормированные медианные значения концентрации холестерина в лунках и вставках для различных вариантов эндотелиальных клеток, 25-й и 75-й процентили

Table 1. Normalized median cholesterol concentrations in wells and inserts for various endothelial cell variants, 25^th and 75^th percentiles

Тип клеток Cell type	Время инкубации, часы Incubation time, hours	НК (К-) Well control			НК (О) Well test			ВК (К-) Insert control			ВК (О) Insert test
		25	Медиана Median	75	25	Медиана Median	75	25	Медиана Median	75	25	Медиана Median	75
ТЭК TEC	0	0,941	0,969	1,068	0,917	1,000	1,083	0,887	0,984	1,158	0,973	1,014	1,052
	2	1,007	1,091	1,129	1,104	1,173	1,235	0,821	0,874	1,074	0,925	0,971	1,074
	5	0,975	1,049	1,234	1,110	1,313	1,504	0,922	0,949	1,063	0,890	0,915	1,050
	24	0,746	1,146	1,228	1,130	1,646	1,842	0,483	0,736	0,957	0,785	0,797	0,828
МВЭК MVEC	0	0,957	1,027	1,075	0,943	0,959	1,098	0,856	1,082	1,090	0,905	0,932	1,083
	2	0,773	1,038	1,112	0,797	0,936	1,042	0,801	0,886	1,117	0,817	0,870	1,135
	5	0,883	0,954	1,117	0,772	1,002	1,402	0,681	0,831	1,176	0,740	0,812	0,853
	24	0,777	0,887	1,080	1,259	1,624	1,794	0,861	0,985	1,126	0,628	0,657	0,790

Примечание. * МВЭК – многоядерные варианты эндотелиальных клеток

Note. * MVEC, Multinucleated variant endothelial cells

 

Однако при сравнении содержания холестерина в ВК нами было обнаружено, что концентрация общего холестерина для ТЭК статистически значимо снижается спустя 24 часа в 1,27 раз (p < 0,05), в то время как для МВЭК – в 1,15 раз (p < 0,05) уже спустя 5 часов с момента добавления ЛПНП. Мы предположили, что подобные отличия могут свидетельствовать о разнице в степени накопления холестерина самими клетками, и МВЭК интернализуют ЛПНП активнее, чем ТЭК.

Для проверки гипотезы мы измеряли соотношение холестерина к общему белку на 500 тыс. клеток, было подтверждено, что концентрация холестерина в МВЭК в 1,17 раз выше, чем в клетках EA.hy926 (p < 0,05) (рис. 1).

 

Рисунок 1. Нормализованное соотношение холестерина к белку для EA.hy926 и ГМЭК

Примечание. р – достоверность различий показателей между группами рассчитана согласно непараметрического критерия Вилкоксона, различия считаются достоверными и статистически значимыми при р < 0,05.

Figure 1. Normalized cholesterol to protein ratio for EA.hy926 and GMEC

Note. p, significance of differences in indicators between groups is calculated according to the non-parametric Wilcoxon test, the differences are considered reliable and statistically significant when p < 0.05.

 

В результате исследования скорости миграции макрофагов через монослой различных вариантов эндотелиальных клеток было показано, что при обработке моноцитов GM-CSF, миграции на протяжении 24 часов не происходило. В случае с макрофагами М1, спустя 2 часа и 5 часов скорость миграции выше для МВЭК (p < 0,001). Однако спустя 24 часа скорость миграции для ТЭК и для МВЭК статистически не различалась.

Заключение

В настоящее время хорошо известно, что артериальные ЭК морфологически гетерогенны по размеру и плоидности: в эндотелии кроме одноядерных встречаются также многоядерные варианты эндотелиальных клеток. В стенке сосудов с атеросклеротическими поражениями в большом количестве встречались МВЭК, что дало основание исследователям предположить, что эти клетки участвуют в патогенезе атеросклероза [5, 6, 10]

Хотя уже было известно, что МВЭК имеют повышенную способность поглощать ЛПНП [5, 9], оставалось выяснить влияет ли наличие многоядерных вариантов эндотелиальных клеток на скорость трансэндотелиального транспорт липопротеидов и миграцию клеток имунной системы в субэндотелиальный слой.

В настоящем исследовании было обнаружено, что скорость трансэндотелиального транспорта для типичных и многоядерных вариантов эндотелиальных клеток статистически не различается через 2, 5 и 24 часа. Хоть наличие МВЭК не виляет на транспорт липопротеидов в субэндотелиальный слой, тот факт, что многоядерные клетки аккумулируют липидные капли активнее, чем типичные ЭК, может указывать на важное значение в патогенезе атеросклероза.

Также было обнаружено, что скорость миграции макрофагов спустя 2 и 5 часов была выше для МВЭК, чем для ТЭК, тогда как незрелые макрофаги в течение 24 часов не мигрировали через эндотелиальный барьер.

Публикация размещена при участии Балтийского федерального университета им. И. Канта.

About the authors

V. R. Cherednichenko

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Author for correspondence.
Email: cherednichenko_vadim@bk.ru

Junior Research Associate, Department of Pathological Morphology, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of the Cardiovascular System

Russian Federation, Moscow

U. S. Khovantseva

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: cherednichenko_vadim@bk.ru

Junior Research Associate, Department of Pathological Morphology, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of the Cardiovascular System

Russian Federation, Moscow

V. V. Kuzmin

Lomonosov Moscow State University

Email: cherednichenko_vadim@bk.ru

Student, Biotechnology Faculty

Russian Federation, Moscow

N. F. Chertovich

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: cherednichenko_vadim@bk.ru

Research Engineer, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of the Cardiovascular System

Russian Federation, Moscow

A. M. Markin

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: cherednichenko_vadim@bk.ru

Junior Research Associate, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of the Cardiovascular System

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files