Protective role of hypoxia-induced factor-1α and HIF-1A gene polymorphism in the development of acute pancreatitis

Full Text

Введение

Острый панкреатит (ОП) – часто встречающееся острое хирургическое заболевание, которое составляет 28-45% от всех острых заболеваний брюшной полости [1]. У большинства пациентов ОП протекает в легкой форме, однако у 20-30% развивается тяжелая форма с летальностью, достигающей 25%. Неутешительные результаты лечения заставляют исследователей не прекращать научный поиск, искать новые, более информативные методы диагностики ОП, эффективные методы лечения этого заболевания [1]. В патогенезе ОП ключевая роль принадлежит гиперактивации ферментов поджелудочной железы (ПЖ), нарушению микроциркуляции в ПЖ и прилегающих тканях. Это приводит к гипоксемии и ацидозу, а прогрессирование воспалительного процесса способствует активации свертывающей системы крови и тромбозу мелких сосудов с развитием острой ишемии ПЖ. Воздействие медиаторов воспаления на эндотелий микроциркуляторного русла также способствует пропотеванию плазмы через сосудистую стенку и плазмопотере, развитию эндотоксикоза и органной недостаточности [2]. Гипоксия, возникающая при ОП, в том числе связана с активацией специфического регуляторного белка – транскрипционного фактора или гипоксией индуцируемого фактора-1á (от англ. hypoxia-induced factor, HIF-1á). HIF-1á играет главную роль в системном ответе организма на гипоксию, отвечает за формирование краткосрочной и долговременной адаптации к гипоксии [5, 9]. Активность продукции HIF-1á увеличивается при снижении напряжения кислорода в крови. Несмотря на актуальность проблемы острого панкреатита в ургентной хирургии и большое количество публикаций, посвященных патогенезу заболевания, сведения о роли HIF-1á в развитии ОП весьма ограничены [7, 10, 12].

HIF-1á входит в группу транскрипционных факторов HIF-s, имеющих 3 субъединицы, каждая из которых кодируется соответствующим геном. HIF-1 – это гетеродимер, содержащий две белковые субъединицы: HIF-1á (73-120 kDa) – зависит от кислорода и HIF-1â (91-94kDa) – не зависит от кислорода и экспрессируется постоянно [8]. HIF-1á кодируется одноименным геном HIF-1A, локализованным на длинном плече (q-плече) 14-й хромосомы. При нормальной концентрации кислорода (при нормоксии) в большинстве клеток ген HIF-1A конститутивно экспрессируется на низких уровнях. HIF-1á в присутствии кислорода подвергается гидроксилированию, связывается с консервативным белком убиквитином, который участвует в регуляции процессов внутриклеточной протеасомной деградации других белков [15]. В условиях гипоксии в клетке гидроксилирования не происходит, HIF-1-á стабилизируется и димеризуется со второй кислород-нечувствительной субъединицей HIF-1â, которая также называется ядерным трансклокатором AH-рецептора (ARNT) (сокр. от англ. Arylhydrocarbon receptor nuclear translocator). Получившийся комплекс транслоцируется в ядро, где связывается с гипоксия-зависимыми элементами (hypoxia response elements, HREs) и запускает генетическую программу выживания клетки в условиях дефицита кислорода, регулируя экспрессию более чем ста генов [6]. Гены, экспрессия которых регулируется транскрипционным фактором HIF-1, участвуют в клеточной пролиферации, ангиогенезе, нейрогенезе, эритропоэзе и клеточном метаболизме (анаэробный гликолиз – лактатдегидрогеназа, пируваткиназа), поддержании внутриклеточного pH, повышая адаптацию ткани к ишемии [13]. Генетические исследования в данной когорте пациентов потенциально могли бы выявить возможные генетические предикторы развития тяжелого ОП на самых ранних стадиях.

Цель – изучить связь содержания HIF-1á в крови и полиморфизма гена HIF-1A с критериями гипоксии, тканевого повреждения и тяжести острого панкреатита.

Материалы и методы

Обследовано 93 пациента с ОП различной степени тяжести в 1-е и 3-и сутки заболевания в возрасте 48 (39-67) лет. Критерии включения: пациенты с острым панкреатитом различной степени тяжести, возраст от 20 до 80 лет. Критерии исключения: наличие хронических гепатитов В и С, ВИЧ, наркозависимости, онкологических и аутоиммунных заболеваний. Степень тяжести ОП определяли по шкале критериев первичной экспресс оценки тяжести острого панкреатита СПб НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе (шкала НИИСП) и по шкале классификации острого панкреатита Российского Общества Хирургов [4]. Пациенты были распределены на 3 группы в зависимости от тяжести заболевания: легкая степень – 32 человек (35%), средняя степень – 26 человек (28%), тяжелая степень – 35 человек (37%). Группа сравнения – 25 здоровых волонтеров, средний возраст – 47 (39-56) лет. Оценивали содержание в крови гипоксией индуцируемого фактора HIF-1á (ИФА, Ray Bio, США), наличие полиморфизма гена HIF-1А (Rt-PCR, CFX-96 (Bio-Rad, США) с использованием специфичных праймеров и зондов к гену HIF-1А НПФ «Литех», Россия), интерлейкина-6 (IL-6), (ИФА, АО «Вектор-Бест», Россия), СРБ (Cobas c601, Roche Diagnostics, Швейцария), прокальцитонина, ферритина (Architect i2000, Abbot, США), белка S100 (ИФА-ХЕМА, Россия), D-димера (ИФА, АО «Вектор-Бест», Россия), клинический анализ крови (Sysmex XN1000), газовый состав крови (Cobas b221, Roche Diagnostics, Швейцария).

Статистическая обработка результатов проведена с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0; определяли медиану (Ме) и персентили (Q_0,25-Q_0,75), коэффициент корреляции Спирмена, отношение шансов (ОШ). При корреляционном анализе показателей с исходом заболевания выписанным пациентам присваивали 1 балл, умершим – 0 баллов. Статистическая значимость принималась при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Острая фаза панкреатита у всех больных характеризовалась типичной для данного заболевания клинической картиной, ферментемией и данными инструментальной диагностики. Больные поступали с интенсивным болевым синдромом в брюшной полости, диспептическими проявлениями, слабостью и тахикардией. При поступлении в стационар у больных наблюдали усиление секреции амилазы, наиболее выраженное при легкой степени тяжести – 948 (418-1836) ед/л, которая снижалась к 3-м суткам у больных всех групп в 5,8-6,3 раза, но не достигала уровня нормальных значений (51 (43-55) ед/л). Аналогичная картина наблюдалась при определении активности липазы: максимальный уровень липазы также был у пациентов с ОП легкой степени – 1225 (256-1463) ед/л), снижался к 3-м суткам во всех группах в 5,3-6,3 раза, не достигая референсных значений (34,7 (30,7-47,6) ед/л).

Одновременно наблюдались метаболические изменения, проявившиеся в развитии гипергликемии, гипопротеинемии, гипоальбуминемии, повышении уровня лактатдегидрогеназы и в снижении содержания холестерина в крови. У больных с тяжелым ОП сохранялась умеренная гипергликемия (7,0 (5,81-10,0), в то время как у пациентов с легкой и средней тяжестью уровень глюкозы к 3-м суткам нормализовался. Гипоальбуминемия наблюдалась в 1-е и 3-и сутки у всех больных с ОП и была наиболее выражена и прогрессировала (до 18,6 (14,8-21,0) г/л) у пациентов с ОП тяжелой степени и летальным исходом.

Развитие воспаления было ассоциировано с увеличением концентрации в крови острофазовых медиаторов: значительно возрастал уровень IL-6, который сохранялся и в 3-и сутки наблюдения (табл. 1); усиливалась продукция С-реактивного белка, наиболее выраженная у пациентов со средним (197 (78-283) г/л) и тяжелым (157 (48-371) г/л) ОП; повышалось содержание фибриногена (до 7,2 (6,0-9,0) г/л) и D-димера у пациентов с тяжелым ОП (табл. 2).

 

Таблица 1. Содержание IL-6 (нг/мл) в крови пациентов с ОП различной степени тяжести

Table 1. Blood levels of IL-6 (ng/mL) in patients with AP of varying severity

Группы по тяжести течения ОП Groups by severity of AP	1-е сутки 1st day	3-и сутки 3rd day
Группа сравнения Comparison group n = 25	0,81 (0,15-2,06)	0,81 (0,15-2,06)
Легкая степень Mild degree n = 32	41,9 (14,9-76,1) * р = 0,001 ** р = 0,000 *** р = 0,011	23,8 (11,6-29,4) * р = 0,000 ** р = 0,000 *** р = 0,027
Средняя степень Moderate degree n = 26	140 (45-241) * р = 0,006 **** р = 0,000	81 (28-195) * р = 0,000 **** р = 0,044
Тяжелая степень Severe degree n = 35	256 (119-491) * р = 0,045	163 (99-388) * р = 0,000

Примечание. р – различия между группами. * – ОП легкой, средней и тяжелой степени и группой сравнения. ** – легкой степени и средней степени. *** – легкой степени и тяжелой степени. **** – средней степени и тяжелой степени (выжившие).

Note. p, differences between groups. *, mild, moderate and severe AP and comparison group. **, mild and moderate. ***, mild and severe. ****, moderate and severe (survivors).

 

Таблица 2. Содержание D-димера (нг/мл) в крови пациентов с ОП различной степени тяжести

Table 2. Blood levels of D-dimer (ng/mL) in patients with AP of varying severity

Группы по тяжести течения ОП Groups by severity of AP	1-е сутки 1st day	3-и сутки 3rd day
Группа сравнения Comparison group n = 25	199 (167-227)	199 (167-227)
Легкая степень Mild degree n = 32	2070 (906-2835) * р = 0,001 *** р = 0,040	1174 (913-1776) * р = 0,001 ** р = 0,016 *** р = 0,000
Средняя степень Moderate degree n = 26	2704 (1308-5825) * р = 0,003	2285 (1074-5064) * р = 0,002
Тяжелая степень Severe degree n = 35	2719 (1759-5687) * р = 0,003	5205 (2462-7158) * р = 0,000

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

Также наблюдали значительный рост содержания ферритина как неспецифического фактора воспаления, наиболее выраженный у пациентов с ОП средней и тяжелой степени (табл. 3).

 

Таблица 3. Содержание ферритина (нг/мл) в крови пациентов с ОП различной степени тяжести

Table 3. Blood levels of ferritin (ng/mL) in patients with AP of varying severity

Группы по тяжести течения ОП Groups by severity of AP	1-е сутки 1st day	3-и сутки 3rd day
Группа сравнения Comparison group n = 25	42,8 (30,7-105)	42,8 (30,7-105)
Легкая степень Mild degree n = 32	211 (120-373) * р = 0,02 ** р = 0,015 *** р = 0,004	33 5 (179-393) * р = 0,00 ** р = 0,002 *** р = 0,001
Средняя степень Moderate degree n = 26	406 (156-714) * р = 0,008 **** р = 0,031	443 (329-866) * р = 0,001
Тяжелая степень Severe degree n = 35	548 (295-1319) * р = 0,012	831 (596-1615) * р = 0,009

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

При поступлении у пациентов с тяжелым ОП наблюдали эритроцитоз -4,9 (4,6-5,4) × 10¹²/л и гипергемоглобинемию – 159 (141-175) г/л, достигающие у умерших больных с фульминантным течением ОП наиболее высоких значений: 5,2 (4,7-5,5) × 10¹²/л и 161 (137-176) г/л соответственно. Но уже на 2-3-и сутки заболевания у больных этой категории развивалась нормохромная нормоцитарная анемия: эритроциты 3,6 (2,8-3,7) × 10¹²/л, гемоглобин 109 (87-123) г/л. В основе развития острой анемии при тяжелом ОП могут быть анорексия, высокая концентрация IL-6, гипопротеинемия, системное воспаление, функциональная недостаточность печени и слизистой оболочки кишок и цитолиз [2].

В 1-е сутки острого панкреатита выявлена корреляционная зависимость уровня гемоглобина, лактата и числа тромбоцитов с исходом заболевания (r = -0,358, р < 0,01; r = -0,811, р < 0,001 и r = 0,273, р < 0,05 соответственно), а его тяжесть в большей степени была ассоциирована с концентрацией лактатдегидрогеназы (r = 0,423, р < 0,05).

Таким образом, у пациентов с ОП различной степени тяжести наблюдали лабораторные признаки острого воспаления, нарушения микроциркуляции, гипоксии и органной дисфункции. Картину гипоксии и тканевого повреждения у таких больных дополнили сведения, полученные при исследовании содержания в сыворотке крови белка HIF-1á и полиморфизма гена HIF-1A.

У пациентов с ОП легкой степени тяжести в 1-е и 3-и сутки наблюдения высокий уровень содержания HIF-1á в крови значительно превышал содержание этого показателя в группе сравнения (в 8 раз и в 20 раз соответственно). При этом у больных со среднетяжелым и тяжелым ОП способность к выработке HIF-1á как фактора адаптации к гипоксии снижалась (табл. 4). Таким образом выявлена связь содержания HIF-1á в крови с тяжестью течения ОП по шкале НИИСП на 1-е и 3-и сутки заболевания, (r = -0,244, р < 0,05 и r = -0,345, р < 0,01 соответственно).

 

Таблица 4. Содержание HIF-1á (пг/мл) в крови у пациентов с ОП различной степени тяжести

Table 4. Blood levels of HIF-1á (pg/mL) in patients with AP of varying severity

Группы по тяжести течения ОП Groups by severity of AP	Тяжесть ОП по шкале НИИСП, баллы AP severity according to the DRIEM scale, points	1 сутки 1 day	3 сутки 3 day
Группа сравнения Comparison group n = 25	–	40 (16,5-56,5)	40 (16,5-56,5)
Легкая степень Mild degree n = 32	1 (1-2) ** р = 0,000 *** р = 0,000	331 (98-19077) * р = 0,03	824 (95-20729) * р = 0,02
Средняя степень Moderate degree n = 26	3 (3-3) **** р = 0,000	94 (56-478)	150 (61-295)
Тяжелая степень Severe degree n = 35	7 (6-9)	67 (45-292)	62 (36-156)

Примечание. * – различия между группами с ОП легкой степени и группой сравнения; ** – различия между группами легкой степени и средней степени; *** – различия между группами легкой степени и тяжелой степени; **** – различия между группами средней степени и тяжелой степени. Тяжесть ОП по шкале НИИСП, баллы – шкала критериев первичной экспресс оценки тяжести острого панкреатита СПб НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе.

Note. p, differences between groups; *, mild AP and comparison group; **, mild and moderate; ***, mild and severe; ****, moderate and severe. DRIEM scale – scale of criteria for primary express assessment of the severity of acute pancreatitis St. Petersburg I. Dzhanelidze Research Institute of Emergency Medicine.

 

Кроме этого, у этих пациентов были выполнены исследования полиморфизма гена HIF-1A (1772С>T, rs11549465) в Rt-PCR для выявления носительства генотипов С/С, С/Т и Т/Т. Известно, что степень экспрессии гена HIF-1A, кодирующего продукцию белка HIF-1á, в значительной степени определяется его генетическим полиморфизмом: миссенс-полиморфизм (точечная мутация), или замена, цитозина (С) на тимин (Т) в положении 1772 в гене HIF-1А приводит к изменению аминокислотной последовательности в белке HIF-1á с пролина на серин. Эта замена повышает стабильность белка HIF-1á и его транскрипционную активность [14]. В популяции встречается 3 варианта носительства генотипа HIF-1A: С/С – наиболее часто встречаемый мажорный тип, С/Т – гетерозиготный генотип встречается реже, Т/Т – наиболее редко встречаемый минорный генотип.

Результаты нашего исследования показали, что среди обследованных больных ОП преобладали пациенты с носительством генотипа С/С, у которых концентрация HIF-1á в крови была ниже, чем в группе с С/Т, т. е. они обладали меньшей устойчивостью к гипоксии (табл. 5).

 

Таблица 5. Содержание HIF-1á в крови у пациентов с ОП различной степени тяжести в зависимости от генотипа гена HIF-1A

Table 5. Blood levels of HIF-1á in patients with AP of varying severity depending on the genotype of the HIF-1A gene

Генотипы HIF-1A Genotypes HIF-1A	HIF-1á, пг/мл HIF-1á, pg/mL	Степени тяжести ОП AP severity	%	HIF-1á пг/мл HIF-1á, pg/mL
С/С, 88%	142 (53-626)	легкая mild	23	816 (93-17736)
		средняя moderate	28	69 (46-185)
		тяжелая severe	49	156 (48-338)
С/Т, 12%	12135 (961-22247) р = 0,032	легкая mild	67	23085 (21923-24247)
		средняя moderate	22	11092 (7300-14883)
		тяжелая severe	11	10 (10-10)

Примечание. р – достоверность между группами.

Note. p, differences between groups.

 

Различия в экспрессии транскрипционного фактора HIF-1á вероятно объясняется аллельным полиморфизмом, который определяет резистентность к гипоксии. Известно, что носители гетерозиготы С/Т, для которых характерна замена пролина на серин (Pro582Ser; C1772T), обладают повышенной продукцией белка HIF-1á [3, 11], следовательно, повышенной устойчивостью к гипоксии и имеют шанс на более легкое течение заболевания.

Летальность среди обследованных больных из группы с генотипом С/С и с тяжелым течением ОП составила 47%. В группе с генотипом С/Т – все больные были выписаны, в том числе с тяжелым острым панкреатитом.

В группе с носительством генотипа С/T гена HIF-1A преобладали больные с легким течением ОП (в 2,9 раза по сравнению с генотипом С/С) (табл. 5).

При расчете отношения шансов для оценки вероятности различной степени тяжести ОП выявили, что шанс на легкое течение ОП у носителей генотипа С/Т в 7,69 раза выше (р < 0,05), чем у носителей генотипа С/С.

Таким образом, в группе пациентов с гетерозиготным генотипом преобладали больные с более легким течением ОП. Пациенты с генотипом Т/Т в нашем исследовании не были идентифицированы.

Кальций-связывающий белок S100, представляющий собой молекулярный паттерн (DAMP – от англ. damage associated molecular pattern), поступает в кровь в результате повреждения клеток и тканей и вызывает активацию асептического воспаления. Концентрация белка S100 оказалась значительно выше у больных с генотипом С/С (табл. 6). У пациентов c полиморфизмом С/Т содержание S100 имело обратную зависимость от концентрации HIF-1á (r = -0,411, р < 0,01).

 

Таблица 6. Содержание белка S100 в крови у пациентов с ОП различной степени тяжести в 1-е сутки в зависимости от генотипа HIF-1A

Table 6. Blood levels of S100 protein in patients with AP of varying severity on day 1 depending on the HIF-1A genotype

Генотипы HIF-1A HIF-1A genotypes	Концентрация S100 пг/мл (норма 31,9 (13,2-55,8) Concentration S100 pg/mL (norm 31.9 (13.2-55.8)	Достоверность различий между группами Significance of differences between groups
генотип С/С genotype C/C	120 (82,1-132,5)	р = 0,026
генотип С/Т genotype C/T	2,3 (2,65-47,80)

Примечание. р – достоверность между группами.

Note. p, differences between groups.

 

Результаты исследования показали, что в 1-е сутки наблюдения у пациентов с ОП уровень HIF-1á ассоциирован с уровнем рHt крови – pH скорректированный по температуре пациента, (r = -0,391, р < 0,01) и содержанием белка S100 (r = -0,311, р < 0,05), отражающими метаболические изменения в тканях и степень тканевого повреждения.

Выводы

Выявлена связь уровня HIF-1á в крови с маркерами тканевого повреждения, смешанной гипоксии и кислотного-основного состояния.

Среди больных с острым панкреатитом преобладали пациенты с генотипом С/С (88%). Больные с генотипом С/Т не превысили 12% от обследованных, а генотип Т/Т выявлен не был.

Для больных с носительством генотипа С/Т (С1772T) HIF-1A характерно легкое течение заболевания и более высокое содержание HIF-1á, но более низкое – белка S100, что может свидетельствовать о протективной роли транскрипционного фактора.

Полученные результаты позволяют рассматривать генотипы HIF-1A (1772С>T, rs11549465) в качестве потенциальных генетических предикторов тяжести течения ОП.

About the authors

L. P. Pivovarova

St. Petersburg I. Dzhanelidze Research Institute of Emergency Medicine

Email: ivosipova@yandex.ru

PhD, MD (Мedicine), Head, Laboratory Diagnostics Department

Russian Federation, St. Petersburg

O. B. Ariskina

St. Petersburg I. Dzhanelidze Research Institute of Emergency Medicine

Email: ivosipova@yandex.ru

PhD (Biology), Research Associate, Laboratory Diagnostics Department

Russian Federation, St. Petersburg

I. V. Osipova

St. Petersburg I. Dzhanelidze Research Institute of Emergency Medicine

Author for correspondence.
Email: ivosipova@yandex.ru

PhD (Мedicine), Senior Research Associate, Laboratory Diagnostics Department

Russian Federation, St. Petersburg

A. E. Demko

Sain-Petersburg I.I. Dzhanelidze Research Institute of Emergency Medicine, St. Petersburg, Russian Federation

Email: ivosipova@yandex.ru

PhD, MD (Мedicine), Professor, Deputy Director for Research, Head, Hepatosurgery Department

Russian Federation, St. Petersburg

A. A. Ryseva

St. Petersburg I. Dzhanelidze Research Institute of Emergency Medicine

Email: ivosipova@yandex.ru

Clinical Laboratory Diagnostics Doctor, Immunology Laboratory

Russian Federation, St. Petersburg

V. M. Malkova

St. Petersburg I. Dzhanelidze Research Institute of Emergency Medicine

Email: ivosipova@yandex.ru

Surgeon, Junior Research Associate, Hepatosurgery Department

Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files