Effect of statin administration on the inflammatory response of monocytes in patients with atherosclerosis

Full Text

Введение

В настоящее время в многочисленных исследованиях доказана важная роль клеток врожденного иммунитета в контроле воспаления и аномального липидного обмена при атеросклерозе [11]. В ряде исследований продемонстрирована взаимосвязь поляризации макрофагов с прогрессированием атеросклероза [1]. Провоспалительная активация циркулирующих моноцитов, которые дифференцируются в макрофаги в области атеросклеротических поражений, может быть важным механизмом развития хронического воспаления в патогенезе атеросклероза. Показано, что макрофаги, полученные из ЛПС-стимулированных моноцитов у пациентов с субклиническим атеросклерозом, демонстрируют повышенную секрецию провоспалительных цитокинов, ассоциированную с показателями атеросклероза сонных артерий [6].

Препараты группы ингибиторов 3-гидрокси3-метил-глутарил-КоА редуктазы (статины) являются основными средствами антиатеросклеротической терапии и обладают, помимо гиполипидемического действия, рядом эффектов, замедляющих прогрессирование атеросклероза [7, 10]. В частности, в экспериментальных и клинических исследованиях были показаны антитромботические эффекты статинов, улучшение эндотелиальной функции, подавление поляризации макрофагов по воспалительному типу [8]. В животной модели у крыс с гиперхолестеринемией показано, что терапия статинами приводит к значимому снижению количества макрофагов, дифференцированных по воспалительному фенотипу [3]. Несмотря на то, что плейотропный эффект статинов широко обсуждается в современной литературе, механизмы противовоспалительных эффектов статинов недостаточно изучены.

Целью настоящего исследования явилось изучение воспалительной активации и толерантности иммунного ответа моноцитов/макрофагов у больных с гемодинамически значимым атеросклерозом на фоне терапии гидрофильными и липофильными статинами, а также у пациентов с атеросклерозом, не получающих гиполипидемическую терапию.

Материалы и методы

В исследование включали пациентов с гемодинамически значимым атеросклерозом коронарных артерий, у которых по результатам КАГ выявлен атеросклеротический стеноз в коронарных артериях более 65%, в три группы:

1) получающие терапию атовастатином в течение не менее 12 месяцев до включения в исследование, n = 20;

2) получающие терапию розувастатином в течение не менее 12 месяцев до включения в исследование, n = 20;

3) не получавшие терапию статинами в течение года до включения в исследование, n = 20.

Критерии исключения: сахарный диабет 2-го типа, онкологические заболевания, неконтролируемая артериальная гипертензия, декомпенсированные почечная или печеночная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотренной версией 2013 г. Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом ФГБУ НМИЦ Кардиологии им. акад. Е.И. Чазова МЗ РФ 28 февраля 2022 г., протокол № 277. Все участники предоставили письменные информированные согласия до включения в исследование.

Для характеристики участников исследования оценивали следующие факторы сердечно-сосудистого риска: артериальная гипертензия, курение, гиперлипидемия, повышение массы тела, наличие ССЗ у близких родственников в возрасте младше 60 лет. Показатели липидного профиля крови (концентрации общего холестерина, холестерина липопротеидов высокой и низкой плоатности (ЛПВП, ЛПНП) и триглицеридов) определяли стандартными лабораторными методами. Для определения каротидного атеросклероза проводили ультразвуковое дуплексное сканирование сонных артерий.

Первичную культуру моноцитов участников исследования получали из цельной крови методом градиентного центрифугирования в градиенте фиколла с последующей иммуномагнитной сепарацией CD14⁺ моноцитов и использованием колонок и парамагнитных наночастиц (Miltenyi Biotec Inc., США). Выделенные клетки культивировали в двух лунках культурального планшета в количестве 500 тыс. клеток в лунке в среде X-VIVO (Lonza Inc., Германия). В лунке 1 не проводили провоспалительную стимуляцию, оценивали базальную секрецию воспалительных цитокинов TNFα и IL-1β в течение 24 ч после посадки. В лунке 2 проводили провоспалительную стимуляцию клеток с добавлением липополисахарида (ЛПС) в концентрации 1 мкг/мл в течение 24 ч после посадки для оценки ЛПС-стимулированной секреции, далее клетки культивировали в течение 5 суток без воспалительной стимуляции и повторно добавляли ЛПС в концентрации 1 мкг/мл на 24 ч для оценки воспалительного ответа макрофагов на повторную стимуляцию и характеристики толерантности иммунного ответа макрофагов. Концентрацию провоспалительных цитокинов TNFα и IL-1β в образцах культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов (R&D Systems Inc., США).

Для статистического анализа полученных результатов использовали пакет программного обеспечения SPSS 27.0 (SPSS, США). Для оценки различий между группами был использован U-критерий Манна–Уитни. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения, Mean (SD). Корреляционный анализ проводили для оценки взаимосвязи воспалительного ответа моноцитов/макрофагов с факторами риска ССЗ.

Результаты и обсуждение

Группы участников исследования с атеросклерозом коронарных артерий, принимавших аторвастатин или розувастатин более года, а также не получавших гиполипидемическую терапию в течение года до включения в исследование, не отличались достоверно по основным исследованным клиническим и лабораторным показателям. У всех участников исследования выявлен атеросклероз коронарных артерий со степенью стеноза не менее 65% по данным КАГ. Клинико-лабораторные характеристики участников исследования представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Клинико-лабораторные характеристики участников исследования, Mean (SD)

Table 1. Clinical and laboratory characteristics of study participants, Mean (SD)

	Aторвастатин Atorvastatin n = 20	Розувастатин Rosuvastatin n = 20	Без статинов Without statins n = 20
Возраст, годы Age, years	59,9 (6,6) p = 0,155	63,7 (5,5) p = 0,798	63,1 (7,8)
Пол, м/ж Gender, m/f	9/11 p = 0,355	17/3 p = 0,001	9/11
Индекс массы тела, кг/м2 Body mass index, kg/м2	28,7 (2,4) p = 0,078	26,6 (2,9) p = 0,860	26,8 (3,9)
Систолическое АД, мм рт. ст. Systolic BP, mmHg	130 (17) p = 0,569	116 (23) p = 0,248	126 (31)
Диастолическое АД, мм рт. ст. Diastolic BP, mmHg	80 (11) p = 0,950	76 (7) p = 0,144	80 (11)
Курение, % Smoking, %	25 p = 0,731	20 p = 0,478	30
Семейный анамнез ССЗ, % Family history of CHD, %	40 p = 0,753	45 p = 1,0	45
ТИМС ОСА, мм cIMT, mm	0,798 (0,197) p = 0,263	0,810 (0,156) p = 0,758	0,825 (0,157)
Общий холестерин, ммоль/л Total cholesterol, mmol/L	5,2 (0,7) p = 0,117	5,1 (0,8) p = 0,555	4,0 (1,1)
Триглицериды, ммоль/л Triglycerides, mmol/L	1,1 (0,6) p = 0,291	1,4 (0,5) p = 0,884	1,3 (0,9)
ЛПНП, ммоль/л LDL, mmol/L	2,9 (0,8) p = 0,026	3,0 (0,8) p = 0,510	3,1 (0,8)
ЛПВП, ммоль/л HDL, mmol/L	1,5 (0,4) p = 0,535	1,3 (0,4) p = 0,408	1,4 (0,3)

Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (Mean (SD)). АД – артериальное давление; ЛПВП – липопротеиды высокой плотности; ЛПНП – липопротеиды низкой плотности; ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания; ТИМС ОСА – толщина интимо-медиального слоя общих сонных артерий; р – уровень значимости по отношению к контрольной группе.

Note. Data are presented as mean and standard deviation (Mean (SD)). BP, blood pressure; CHD, coronary heart disease; cIMT, carotid intima-media thickness; HDL, high density lipoproteins; LDL, low density lipoproteins; р, significance level in comparison with the control group.

 

Для характеристики провоспалительной активации и толерантности иммунного ответа макрофагов была измерена базальная, ЛПС-стимулированная и повторно стимулированная секреция цитокинов TNFα и IL-1β, результаты представлены в таблицах 2 и 3.

 

Таблица 2. Секреция TNFα в первичной культуре моноцитов/макрофагов участников исследования

Table 2. TNFα secretion in primary culture of monocytes/macrophages of study participants

TNFα, пг/мл TNFα, pg/mL	Aторвастатин Atorvastatin n = 20	Розувастатин Rosuvastatin n = 20	Без статинов Without statins n = 20
Базальная секреция Basal secretion	143 (142) p = 0,396	64 (32) p = 0,031	200 (257)
ЛПС-стимулированная секреция LPS-stimulated secretion	3939 (1717) p = 0,460	3680 (2391) p = 0,345	4611 (3625)
Повторно стимулированная секреция Re-stimulated secretion	113 (52) p = 0,845	82 (42) p = 0,031	117 (56)

Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (Mean (SD)). ЛПС – липополисахарид, р – уровень значимости по отношению к группе без статинов.

Note. Data are presented as mean and standard deviation (Mean (SD)). LPS, lipopolysaccharide; р, significance level in comparison with the group without statins.

 

Таблица 3. Секреция IL-1β в первичной культуре моноцитов/макрофагов участников исследования

Table 3. IL-1β secretion in primary culture of monocytes/macrophages of study participants

IL-1β, пг/мл IL-1β, pg/mL	Aторвастатин Atorvastatin n = 20	Розувастатин Rosuvastatin n = 20	Без статинов Withou statins n = 20
Базальная секреция Basal secretion	107 (55) p = 0,302	72 (37) p = 0,020*	136 (108)
ЛПС-стимулированная секреция LPS-stimulated secretion	1061 (736) p = 0,002*	1004 (743) p = 0,001*	1841 (720)
Повторно стимулированная секреция Re-stimulated secretion	113 (58) p = 0,468	81 (21) p = 0,416	96 (77)

Примечание. См. примечание к таблице 2.

Note. As for Table 2.

 

Базальная секреция TNFα и IL-1β у пациентов, получающих статины, была ниже, чем у пациентов, которые не получали гиполипидемическую терапию в течение последнего года, при этом в группе пациентов, получающих розувастатин, секреция обоих цитокинов была достоверно ниже. ЛПС-стимулированная секреция TNFα и IL-1β после 24 инкубации культивируемых клеток с ЛПС также была ниже в группах пациентов, получающих статины, но только секреция IL-1β была достоверно ниже в группах аторвастатина и розувастатина по сравнению с группой без статинов. Повторно стимулированная секреция IL-1β не отличалась достоверно между группами, повторно стимулированная секреция TNFα была достоверно ниже в группе розувастатина по сравнению с группами аторвастатина и без статинов.

Для оценки взаимосвязи воспалительного ответа моноцитов и традиционных факторов риска ССЗ на фоне терапии статинами был проведен корреляционный анализ. В группе аторвастатина выявлена корреляция базальной секреции TNFα с уровнем общего холестерина и ЛПНП, R = 0,589, p = 0,006 и R = 0,489, p = 0,034 соответственно. В группе розувастатина выявлена отрицательная корреляция секреции IL-1β с уровнем ЛПВП в сыворотке крови, R = 0,464, p = 0,039.

Результаты настоящего исследования демонстрируют противовоспалительную эффективность статинов, которая выражается в подавлении секреции противовоспалительных цитокинов, культивируемыми макрофагами пациентов с атеросклерозом, причем в группе розувастатина показано статистически значимое снижение секреции в отличие от группы аторвастатина, в которой результаты не достигли статистической достоверности. В другом исследовании, направленном на сравнение эффективности липофильных и гидрофильных статинов, также показано значимое снижение секреции провоспалительных цитокинов в модели in vitro, при этом аторвастатин был достоверно более эффективен [9]. Однако исследование проводилось на первичной культуре моноцитов-макрофагов, полученных от здоровых доноров. Секреция цитокинов, индуцированная ЛПС, определялась после инкубации клеток со статинами, т. е. данный метод не учитывает особенностей воспалительной активации моноцитов у пациентов с атеросклерозом.

Ранее было показано, что статины вызывают различные провоспалительные реакции на клеточных и животных моделях. Липофильные статины, в частности аторвастатин, влияют на регуляторные пути в моноцитах, которые контролируют продукцию воспалительных цитокинов [2, 5]. Одним из механизмов противовоспалительного действия аторвастатина является ингибирование функции инфламмасом NLRP3, которые являются источником медиаторов воспаления, в частности провоспалительных цитокинов TNFα и IL-1β [4]. В других исследованиях показано, что в моноцитах пациентов с атеросклерозом на фоне терапии розувастатином значимо повышена экспрессия маркеров поляризации макрофагов по М2-фенотипу, в частности противовоспалительных медиаторов ССL18 и IL-10 [12].

Заключение

Результаты настоящего исследования демонстрируют противовоспалительную эффективность статинов, выражающуюся в снижении секреции провоспалительных цитокинов TNFα и IL-1β культивируемыми моноцитами/макрофагами пациентов с выраженным коронарным атеросклерозом, получающих терапию аторвастатином и розувастатином, по сравнению с пациентами с атеросклерозом, не получавшими терапию статинами. При этом наиболее выраженное и статистически достоверное снижение секреции TNFα и IL-1β наблюдалось в группе пациентов, получающих розувастатин. Таким образом, розувастатин можно рассматривать как препарат выбора для патогенетической терапии и профилактики атеросклероза и ассоциированных сердечно-сосудистых заболеваний, однако требуются дополнительные исследования с большим количеством участников, более длительным сроком терапии и более широким спектром исследуемых цитокинов.

About the authors

T. V. Kirichenko

Petrovsky National Research Centre of Surgery; Chazov National Medical Research Center of Cardiology

Author for correspondence.
Email: t-gorchakova@mail.ru

PhD (Medicine), Senior Research Associate, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of the Cardiovascular System; Research Associate, Laboratory of Medical Genetics

Russian Federation, Moscow; Moscow

I. Yu. Yudina

I. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: t-gorchakova@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Clinical Pharmacology and Propaedeutics of Internal Diseases, Sklifosovsky Institute of Clinical Medicine

Russian Federation, Moscow

M. V. Lukina

I. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: t-gorchakova@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Clinical Pharmacology and Propaedeutics of Internal Diseases, Sklifosovsky Institute of Clinical Medicine, Clinical Pharmacologist of the University Clinical Hospital No. 1

Russian Federation, Moscow

T. B. Andrushchishina

I. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: t-gorchakova@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Clinical Pharmacology and Propaedeutics of Internal Diseases, Sklifosovsky Institute of Clinical Medicine, Clinical Pharmacologist of the University Clinical Hospital No. 1

Russian Federation, Moscow

I. V. Zhivodernikov

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: t-gorchakova@mail.ru

PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of the Cardiovascular System

Russian Federation, Moscow

Yu. V. Markina

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: t-gorchakova@mail.ru

PhD (Medicine), Senior Research Associate, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of the Cardiovascular System

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files