Co-cultivation of mastocytes and cumulus cells in polycystic ovary syndrome

Full Text

Введение

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) характеризуется нарушением менструального цикла, гиперандрогенией, морфологией поликистозных яичников [1, 3]. Диагноз СПКЯ основывается минимум на двух из трех вышеперечисленных признаках [3]. Распространенность СПКЯ у женщин репродуктивного возраста по данным Клинических рекомендаций «Современные подходы к лечению и диагностике синдрома поликистозных яичников в репродуктивном возрасте» 2022 года под редакцией Л.В. Адамян достаточно высокая, составляет от 6-9% до 19,9% [1]. Нарушение менструального цикла, бесплодие, гирсутизм – это симптомы, которые заставляют пациентку обратиться на прием, но это только малая часть изменений присущих СПКЯ, иммунологическая дизрегуляция при СПКЯ, затрагивает не только женскую репродуктивную систему, но и весь организм [13]. Гиперандрогения и инсулинорезистентность обуславливают дисфункцию иммунных клеток и влияют на дисбаланс цитокинов [13]. Согласно современной номенклатуре аллергических заболеваний и реакций гиперчувствительности, пересмотренной Европейской академией аллергии и клинической иммунологии [5], реакции гиперчувствительности расширены до девяти типов, VI тип, включает метаболически – индуцированную иммунную дисфункцию, к VI типу относится СПКЯ [5]. В 1988 г. Thibault C. и Levasseur M.C. изучали влияние гистамина на овуляцию [11], в норме во время фолликулогенеза происходят биохимические и цитологические изменения в стенке фолликула, распад апикальной части фолликула, созревание ооцита. В разрушении верхушки фолликула играет роль коллагеназы, гистамин, плазмин [11]. Годом позже Krishna A. и его коллеги выявили, что у человека тучные клетки распределены во всех частях яичника, гистамин принимает участие в регуляции проницаемости капилляров и кровотока в яичниках, под воздействием лютеинизирующего гормона [6]. Гены, связанные с врожденными иммунными реакциями и функциями иммунных клеток (фактор комплемента q1, CD14 и Toll-подобные рецепторы (TLR) 4, 8 и 9, медиаторы активации TLR, регуляторный фактор интерферона 3) экспрессируются в кумулюсных клетках, соответственно кумулюсные клетки приобретают функции иммунных клеток в преовуляторном периоде и во время овуляции [9, 10]. Выявлено, что интерлейкин-6 действует как мощный аутокринный регулятор функции кумулюсных клеток (КК) яичников, расширения кумулюсно-ооцитарного комплекса (КОК) и качества ооцитов [7]. Проведенные исследования доказывают, что МС вовлечены в патологию «женское бесплодие» при имплантации, беременности, потерях беременности [2]. МС могут продуцировать эстрадиол и прогестерон [2]. Гистамин МС (тучных клеток) благоприятно влияет на имплантацию благодаря участию гистамина в ремоделировании тканей. Триптаза и химаза активируют матриксные металлопротеиназы 2-го типа (ММР2) и матриксные металлопротеиназы 9-го типа (ММР9), влияя на деградацию внеклеточного матрикса во время физиологического менструального цикла [2]. МС сосредотачиваются на внешней теке доминатного фолликула, в интерстициальной коре и мозговом веществе яичника больше триптазо-позитивных МС, чем химазо-позитивных [4], было выявлено, что количество МС в яичниках у пациенток с СПКЯ значительно ниже, в сравнению с яичниками пациенток без СПКЯ [4]. Обнаружены значимые количества триптазы в фолликулярной жидкости и семенной жидкости человека и МС – триптазо-положительных клетки в стенке фаллопиевых труб человека [14]. Во время естественного оплодотворения только сперматозоиды, которые пересекают КОК получают возможность достичь и проникнуть в зону пеллюцидов и оплодотворить ооцит. Если овулированный ооцит полностью лишен кумулюсного оофорного комплекса, он остается неоплодотворенным [12]. Выявлено, что триптаза напрямую взаимодействует со сперматозоидами человека во время их миграции по женской репродуктивной системе [14], эти открытия позволяют думать о взаимодействии кумулюсных клеток и сперматозоида, при помощи триптазы, т. е. продукта дегрануляции МС. Изучение КК, находящихся в тесном контакте с ооцитом позволяет судить о качестве яйцеклетки и прогнозировать исход ее оплодотворения [12]. Роль клеток врожденного иммунитета является предметом активного исследования при аутоиммунной патологии эндокринной системы и при синдроме поликистозных яичников (СПКЯ).

Целью исследования является изучение функциональных возможностей кумулюсных клеток яичника при СПКЯ по их цитокинпродуцирующей функции, в том числе при сокультивировании КК с мастоцитами для выявления их взаимного влияния и роли в иммунопатогенезе синдрома поликистозных яичников. Необходимы дальнейшие исследования с использованием первичных культур кумулюсных клеток и МС для изучения их возможных межклеточных взаимодействий и влияния половых гормонов на активацию КК и МС в яичнике.

Материалы и методы

Исследование одобрено Междисциплинарным этическим комитетом ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (протокол № 9 от 16.05.2022 г.). Использовалась постоянная линия тучных клеток человека HMC-1 (Human mast cell, ATCC, США) и первичная культура кумулюсных клеток. После подписания добровольного информированного согласия в исследовании, использовались кумулюсные клетки пациенток, отделенных от ооцита, не используемые в дальнейшей процедуре ИКСИ при ЭКО после проведения трансвагинальной пункции в условиях стерильной операционной в асептических условиях специализированной клиники. Механическое отделение КК от ооцита без нарушения его целостности делает возможным применение КК в исследованиях, что никак не нарушает права эмбриона. КК человека были получены от 12 здоровых доноров (средний возраст 28,6±5,3 лет) и 10 пациенток СПКЯ (средний возраст 29,4±3,6 лет), прошедших процедуру ЭКО-ИКСИ в клинике репродукции г. Владивостока. Для стимуляции яичников и созревания фолликула использовались стандартные протоколы вспомогательных репродуктивных технологий.

После получения кумулюсно-ооцитарных комплексов происходит механическое отделение КК от ооцита. Изолированные КК – в лаборатории клеточных технологий ННЦМБ ДВО РАН механически диссоциированы на отдельные клетки и посажены в 6-луночные планшеты для адгезивных культур (ТРР, Швейцария). Кумулюсные и тучные клетки (МС, постоянная линия тучных клеток человека HMC-1 – Human mast cell, ATCC, США) сокультивировали в соотношении 2:1 при 37 °C, 5% CO₂ и влажности 95%. В качестве среды использовали IMDM (модифицированную по Дульбекко среду Игла, Sigma-Aldrich; Дармштадт, Германия) с добавлением 20%-ной эмбриональной бычьей сыворотки FBS (HyClone, США), смеси заменимых аминокислот MEM NEAA (Gigbo, США), смеси незаменимых аминокислот MEM EAA (Sigma-Aldrich, США), 1 мМ пирувата натрия (Gigbo, США), 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Gigbo, США). Смена среды производили каждые 3 суток. Состояние КК и МС определяли с помощью флуоресцентных красителей с последующей проточной цитометрией перед посадкой клеток и через 7 суток их сокультивирования. Клетки открепляли из лунок планшета с помощью смеси 0,05% трипсин – 0,02% EDTA осаждали центрифугированием при 500 g в течение 5 мин при RT. К осадкам клеток из индивидуальных лунок добавляли 100 мкл смеси красителей: 4’,6 диамидино-2-фенилиндол (ДАПИ, Sigma-Aldrich) в конечной концентрации 1 мкг/ мл для окрашивания мертвых клеток, H2DCFDA (Sigma-Aldrich, США) в конечной концентрации 10 мкг/ мл для окрашивания клеток с функционально-активными митохондриями, TO-PRO-3™ (Thermo Scientific, США) в конечной концентрации 1 мкМ для окрашивания апоптотических клеток. Окрашивание производили в течение 10 мин при RT. После этого суспензии анализировали на проточном цитофлуориметре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США), подключенном к компьютеру с лицензионным программным обеспечением CytExpert (v. 2.5, Beckman Coulter, США). Для анализа использовали не менее 10 тыс. событий. Открепление клеток смесью 0,05% трипсин – 0,02% EDTA (среду из лунок отбираем, ополаскиваем 2 мл DPBS (Sigma-Aldrich, США) без ионов Ca²⁺ и Mg²⁺, добавляли смесь трипсина по 700 мкл/ лунку на 10 минут при +37 °C, суспендировали содержимое лунок, переносили в центрифужную пробирку, ополаскивали лунки 2 мл среды, переносили в центрифужную пробирку, центрифугировали 5 мин при 500 g, супернатант убирали, к осадку добавляли свежую среду. В использованной среде на 1-е, 3-и, 7-е сутки при помощи ИФА определялись показатели цитокинов (IL-6, IL-10, IFNã). Ежедневное наблюдение за клетками осуществляли с помощью инвертированного микроскопа CKX41 (Olympus, Япония), оснащенного системой фазового контраста. Съемку проводили камерой AxioCam5 (Carl Zeiss, Германия) с помощью лицензионного программного обеспечения Zen 2, Blue Edition (Carl Zeiss, Германия). Для расчета использовался непараметрический U-критерий Манна–Уитни; при значение р < 0,05 отличия считались значимыми.

Результаты и обсуждение

Параметры изменения цитокинов в различные сутки эксперимента в постоянной линии МС (тучных клеток человека HMC-1) и адгезивной культуре кумулюсных клеток, а также во время совместного культивирования постоянной линии тучных клеток человека HMC-1 и адгезивной культуры кумулюсных клеток представлены на рисунках 1 и 2. Выявлено, что, как в монокультуре, так и при совместном культивировании клеток продолжается синтез цитокинов IL-6, IL- 10, IFNã, но в разной степени выраженности и в зависимости от наличия СПКЯ. В постоянной линии тучных клеток происходит планомерное увеличение IL-6, IL-10, IFNã на 1-е, 3-и, 7-е сутки культивирования. На первые сутки показатели цитокинов КК доноров и МС значимо не отличаются (р > 0,05). В культуре КК доноров синтез IL-6, IL- 10, IFNã значимо и поступательно увеличивается к 7-м суткам эксперимента (р < 0,05).

 

Рисунок 1. Уровень цитокинов при совместное культивирование постоянной линии тучных клеток человека HMC-1 и кумулюсных клеток пациенток с синдромом поликистозных яичников

Figure 1. Cytokine levels during co-cultivation of a permanent line of human mast cells HMC-1 and cumulus cells of patients with polycystic ovary syndrome

 

Рисунок 2. Уровень цитокинов при совместное культивирование постоянной линии тучных клеток человека HMC-1 и кумулюсных клеток здоровых доноров

Figure 2. Cytokine levels during co-cultivation of a permanent line of human mast cells HMC-1 and cumulus cells of healthy donors

 

В культуре КК при СПКЯ уровень IL-6 был изначально выше, в сравнении с контрольной группой и на 3-и, 7-е сутки так же, как и в контроле, повышался, но динамика роста была значительно слабее и показатель цитокина был в 4 раза ниже контроля (р < 0,05). Что может свидетельствовать об истощении КК. При совместном культивировании МС и КК доноров происходит планомерное нарастание IL-6 к 7-м суткам эксперимента (рис. 2). При совместном культивировании КК и МС при СПКЯ происходит наоборот (рис. 1), значимое снижение показателя, что может прямо свидетельствовать о взаимном подавлении цитокинпродуцирующей функции клеток, так как подобного явления в монокультуре мастоцитов не наблюдалось. Значимое исходное повышение после гормональной подготовки к ЭКО уровня IL-6 в среде КК при СПКЯ и дальнейшее его более слабое, по сравнению с контролем, нарастание в динамике свидетельствует о возможно более слабой экспрессии генов IL-6SR на кумулюсных клетках при СПКЯ и прямую зависимость экспрессии от уровня половых гормонов. Более того, значимое снижение IL-6 в случае СПКЯ при сокультивировании КК и МС, может свидетельствовать о слабом восприятии КК активационных сигналов, вероятно, из-за слабой экспрессии генов IL-6SR, и как следствие, активационное истощение КК [9], что требует дальнейших исследований. Сниженный синтез IL-6, как аутокринного регулятора функции кумулюсных клеток яичников и фактора, повышающего компетентность ооцитов [7], свидетельствует о необходимости его коррекции, что позволит реально влиять на звенья иммунопатогенеза СПКЯ в дальнейшем.

Уровень IFNã в монокультуре КК при СПКЯ снижался, но при совместном культивировании с МС, как в группе контроля, так и при СПКЯ на 7-е сутки эксперимента увеличении достигло более, чем пятикратного в сравнении с первыми сутками (p < 0,05). Показатели на 1-е и 3-и сутки в культуре МС и при совместном культивировании МС и КК доноров и СПКЯ значимо не отличались (p > 0,05). В монокультуре КК группы контроля также произошло снижение показателя на 3-и сутки, но на 7-е сутки увеличение составило более чем в 10 раз. В первые сутки эксперимента баланс Th1/Th2 цитокинов при СПКЯ двукратно превышал аналогичный показатель у здоровых женщин, а в динамике соотношение нарастало и на 7-е сутки эксперимента достигло 3,83 раза выше показателя соотношения Th1/Th2 цитокинов в группе контроля.

Содержание IFNã значимо нарастает при сокультивировании мастоцитов и кумулюсных клеток как в норме, так и при СПКЯ. Однако конечные значения при сокультивировании при СПКЯ достоверно превышают аналогичные показатели донорских клеток, и эти данные могут быть созвучны с данными о позитивном влиянии прогестерона на синтез IFNã и негативном влиянии IFNã на вынашивание беременности при СПКЯ [8]. Синтез интерферона-ã при сокультивировании КК и МС при СПКЯ происходит исключительно за счет его продукции тучными клетками, так как в монокультуре КК при СПКЯ синтез IFNã значимо падает практически до следовых значений к 7-м суткам эксперимента, что свидетельствует о функциональном дефиците кумулюсных клеток при данной патологии.

Гиперпродукция IFNã мастоцитами была наиболее значима (в 9,5 раз от исходной) при сокультивировании иммуноцитов с КК, так как в монокультуре тучные клетки синтезировали избыточно цитокин только двукратно от исходных значений IFNã, а среда с монокультурой КК при СПКЯ практически не содержала IFNã к 7-м суткам эксперимента.

IL-10, как известно, оказывает ингибирующее влияние на Th1 ответы и способствует толерантности к аллотрансплантату и, следовательно, может улучшать выживаемость плода. Уровень IL- 10 в нашей культуре КК доноров, при СПКЯ и в культуре МС повышался (p < 0,05), но на 7 сутки увеличение показатели в группе контроля было выше более, чем в 5 раз в сравнении с СПКЯ, и более чем в 3 раза в сравнении с МС (р < 0,05). При совместном культивировании показатель IL-10 снизился на 3-и сутки при СПКЯ, но затем на 7-е сутки увеличился в 2 раза в сравнении с 1-ми сутками, при культивировании КК доноров и МС происходило увеличение IL-10 (р < 0,05).

Продукция IL-10 в клеточных культурах и ее динамика были аналогичны динамике продукции IL-6 – нарастание в монокультурах в норме и при СПКЯ. Однако в случае патологии – КК синтезировали цитокин слабее. При сокультивировании КК и МС данная тенденция сохранялись в целом для IL-6 и IL-10, за исключением продукции интерферона-ã, что нарушало баланс IFNã/IL-10 в сторону цитокинов Th1-типа, и это, в конечном счете, могло определять прогноз течения беременности при СПКЯ и ставить под угрозу вынашивание беременности по сравнению со здоровыми женщинами [13].

По результатам показателей проточной цитометрии, представленных на рисунке 3, показано состояние при совместном культивировании КК от здоровых доноров и МС, на рисунке 4 показано состояние при совместном культивировании КК от пациенток с СПКЯ и МС.

Характеристики КК пациенток с СПКЯ и здоровых доноров отличались изначально со значимым превышением как количества, так и функциональной активности у клеток здоровых лиц. У пациенток СПКЯ плотность клеток изначально составила 3024 клетки/см²; активных клеток 54,7%, а на 7-е сутки плотность клеток увеличилась до 9516 клеток/см², но при этом процент активных клеток снизился до 39,7% (рис. 3). У здоровых доноров плотность клеток изначально составила 7187 клетки /см² и активных клеток было 86,9%, а на 7-е сутки плотность клеток увеличилась до 10285 клеток/см², но при этом активных клеток было 69,8% (рис. 4). При совместном культивировании КК и МС плотность клеток нарастала, но количество активных клеток на 7-е сутки было все равно выше у здоровых доноров, что подтверждает данные, полученные нами при исследовании продукции цитокинов клеточными культурами. В заключение, мы хотели отметить, что исследуемые нами цитокины являются регуляторами функции кумулюсных клеток яичника и факторами повышающими компетентность ооцита свидетельствующие о необходимости их коррекции, что позволит реально влиять на звенья патогенеза в СПКЯ в дальнейшем.

 

Рисунок 3. Показатели цитометрии при совместное культивирование постоянной линии тучных клеток человека HMC-1 и кумулюсных клеток здоровых доноров

Figure 3. Cytometry parameters in the co-cultivation of a permanent line of human mast cells HMC-1 and cumulus cells of healthy donors

 

Рисунок 4. Показатели цитометрии при совместном культивирование постоянной линии тучных клеток человека HMC-1 и кумулюсных клеток пациенток с синдромом поликистозных яичников

Figure 4. Cytometry parameters in the joint cultivation of a permanent line of human mast cells HMC-1 and cumulus cells of patients with polycystic ovary syndrome

 

Благодарности

Благодарность за техническую поддержку экспериментального исследования авторы статьи выражают Федеральному государственному бюджетному учреждению науки «Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского» Дальневосточного отделения Российской академии наук сотрудникам лаборатории клеточных технологий; Грачевой Алине Максимовне, главному врачу клиники репродукции и генетики Next Generation Clinic, г. Владивосток; клинике «Пластэк хирургия», г. Владивосток.

About the authors

O. V. Valikova

Pacific State Medical University; Regional Clinical Hospital No. 2; Cliniс “Plastic Surgery”

Author for correspondence.
Email: renalex.99@mail.ru

Junior Research Associate, Endocrinologist

Russian Federation, Vladivostok; Vladivostok; Vladivostok

V. V. Zdor

Pacific State Medical University; Cliniс for Diabetes and Endocrine Diseases

Email: renalex.99@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Leading Research Associate, Endocrinologist

Russian Federation, Vladivostok; Vladivostok

Ya. N. Tikhonov

Pacific State Medical University

Email: renalex.99@mail.ru

Senior Lecturer, Department of Pathological Anatomy

Russian Federation, Vladivostok

A. V. Boroda

A. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences

Email: renalex.99@mail.ru

PhD, Senior Research Associate, Laboratory of Cell Technology, Deputy Director for Scientific Activities

Russian Federation, Vladivostok

K. G. Kolbin

Clinic for Reproduction and Genetics “Next Generation Clinic”

Email: renalex.99@mail.ru

PhD (Biology), Embryologist

Russian Federation, Vladivostok

References

Supplementary files