Phenotypic heterogeneity of the B lymphocyte population in the context of post-traumatic stress disorder in veterans of modern wars

Full Text

Введение

Посттравматическое стрессовое расстройство у ветеранов боевых действий имеет определенные особенности, характерные для комбатантов [3, 4]. В структуре симптоматики преобладают симптомы патологической гипервозбудимости, интрузий, чувство вины, избегания, аффекты гнева, различные варианты инсомнических и когнитивных нарушений, деструктивные и дефицитарные эпизоды агрессивности [3].

Феноменология разнообразия проявлений ПТСР предполагает наличие двусторонней связи периферических регуляторных систем с центральными нейрофизиологическими механизмами и обусловлена индукцией нейровоспаления циркулирующими иммунными клетками и провоспалительными медиаторами, мигрирующими через поврежденный гематоэнцефалический барьер. Активация провоспалительными медиаторами астроцитов и микроглиальных клеток способствует развитию синаптической дисфункции, потере нейронов и нарушению связности функциональных сетей в областях мозга, отвечающих за эмоциональное обеспечение стресса [8]. Известно, что у пациентов со стресс-индуцированными нейрокогнитивными нарушениями количество и интенсивность активации мононуклеарных клеток периферической крови изменяется в зависимости от стадии или тяжести стресса [7]. Продемонстрировано, что В-лимфоциты могут усугублять нейрокогнитивные нарушения, демонстрируя значительную тенденцию к провоспалению за счет выработки иммуноглобулинов и ряда провоспалительных факторов. Истощение или инактивация В-клеток в головном мозге увеличивает уровень TGF-â микроглии и снижает экспрессию регуляторных молекул TREM2, CLEC7A и ITGAX в гиппокампе, что значительно ослабляет стресс-индуцированное нейровоспаление. В-лимфоциты представляют собой весьма гетерогенную клеточную популяцию, функционирование подмножеств которой регулируется воспалительной средой. Так, экспериментально показано, что активация В-лимфоцитов варьирует от стимулирования превращения переходных клеток B-1a в патогенные В-клетки с высоким содержанием CD137⁺TNFá⁺MHC-I типа, которые затем индуцируют активацию цитолитических CD8⁺Т-клеток, которые могут способствовать прогрессированию нейрокогнитивных нарушений. В то же время в эксперименте показано, что выведение В-клеток значительно ускоряет и усугубляет когнитивный дефицит [14].

Популяция регуляторных В-клеток (Breg) в настоящее время широко признана важным модулирующим компонентом иммунной системы, который подавляет, в том числе, нейровоспаление и участвует в прогрессировании когнитивных нарушений. Недавние исследования показали, что популяции Breg в физиологических условиях крайне малы, но существенно увеличиваются как у людей, так и на мышиных моделях хронических воспалительных заболеваний при стресс-индуцированных состояниях, аутоиммунных заболеваниях, инфекциях [15]. Показано, что практически все известные на сегодняшний день субпопуляции В-клеток могут быть индуцированы с образованием Breg-клеток. Кроме того, существуют уникальные субпопуляции Breg-клеток, такие как B10 и Tim-1⁺В-клетки, иммунорегуляторная функция которых опосредована продукцией цитокинов, таких как IL-10 и TGF-â и последующим подавлением Т-клеток, прямыми межклеточными взаимодействиями или изменением иммунного микроокружения. Фенотипическое и функциональное многообразие В-субпопуляций, участие в процессах нейроиммуномодуляции в условиях формированиея стресс-индуцированных расстройств адаптации явилось предпосылками для настоящего исследования.

Цель – изучение фенотипической гетерогенности В-субпопуляций лимфоцитов у ветеранов с посттравматическим стрессовым расстройством.

Материалы и методы

Исследования проводились на клинической базе ГБУЗ «Челябинский областной клинический терапевтический госпиталь для ветеранов войн» в когорте ветеранов специальной военной операции на Украине (УСВО) средний возраст 46,7±3,2 года, в количестве 56 человек, среди которых 26 комбатантов с клинически верифицированным ПТСР (МКБ-10: F43.1 ПТСР; МКБ- 11: 6B40 ПТСР; DSM-IV (рубрика «Тревожные расстройства» (300.хх)) составили основную (1) группу, 30 ветеранов вошли в состав группы сравнения (2). Длительность пребывания в зоне проведения боевых действий в среднем составило 9,6±2,2 мес. Группу референсных значений (3) составили 20 здоровых военнослужащих, не принимавших участия в боевых действиях (средний возраст 47,7±4,6 года). Обследование ветеранов УСВО проводилось согласно рекомендациями ФГБУ «НМИЦ психиатрии и неврологии имени В.М. Бехтерева» МЗ РФ (Санкт-Петербург) [5]. Критериями исключения являлись психоорганическая патология, ЧМТ в анамнезе, наличие любых заболеваний в стадии декомпенсации.

Проводимые исследования одобрены на заседании этического комитета ООО «ДокторЛаб» (протокол № 3 от 17.10.2020 г.).

Венозную кровь для исследования собирали в утренние часы, натощак. Определение уровня IL-10 (пг/мл) при помощи мультиплексного анализа на иммуноанализаторе Luminex Magpix 100 (США) с использованием тест-системы мультиплексного анализа Bio-Plex (MERZ, Германия).

Гейтирование популяции В-лимфоцитов проводили на проточном цитофлюориметре Navios (Beckman Coulter, США) по стандартизованной технологии оценки лимфоцитарного звена иммунитета [2]. Для выделения пула В-лимфоцитов использованы комбинации маркеров: CD45⁺, CD46⁺, CD3^-, CD19⁺, CD5⁺, CD27⁺, CD127⁺.

Статистическую обработку материала проводили с применением пакета прикладных программ Statistica for Windows vers. 10.0. (StatSoftInc. (США)) с представлением данных в виде медианы и квартильного размаха – Me (Q_0,25-Q_0,75). Для сравнения данных применяли критерий Манна–Уитни для независимых выборок, при достижении уровня значимости (р) не более 0,05.

Результаты и обсуждение

Исходя из возможности комбинирования маркеров В-лимфоцитов, нами выделены следующие фенотипы подмножеств В-лимфоцитов в крови ветеранов УСВО с клиническими проявлениями ПТСР (табл. 1).

 

Таблица 1. Фенотипические варианты популяционной гетерогенности В-лимфоцитов у ветеранов УСВО, Me (Q_0,25-Q_0,75)

Table 1. Phenotypic variants of population heterogeneity of B lymphocytes in USVO veterans, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Параметры Options	Группа 1 Ветераны УСВО с ПТСР Group 1 USVO veterans with PTSD n = 38	Группа 2 Ветераны УСВО без ПТСР Group 2 USVO veterans without PTSD n = 30	Группа 3 Контрольная Group 3 Control n = 20
Общее количество B-лимфоцитов (CD45+CD3- CD19+) , 106 кл/л Total number of B lymphocytes (CD45+CD3-CD19+), 106 cells/L	281,5 (187,1-324,2)	350,2 (299,3-343,2)	316,5 (279,2-318,2)
В-лимфоциты с фенотипом (CD45+CD3-CD19+CD5+), 106 кл/л B lymphocytes with phenotype (CD45+CD3-CD19+CD5+), 106 cells/L	35,4 (28,9-44,7)	22,6 (18,3-26,3)*	20,1 (18,2-23,5)*
В-лимфоциты с фенотипом (CD45+CD3-CD19+CD5-), 106 кл/л B lymphocytes with phenotype (CD45+CD3-CD19+CD5-), 106 cells/L	118,2 (112,3-123,6)	285,3 (245,6-321,4)*	278,6 (269,4-310,4)*
Общее количество В-лимфоцитов, позитивное по CD27 (клетки памяти) (CD 45+CD3-CD19+CD27+), 106 кл/л Total B cells positive for CD27 (memory cells) (CD 45+CD3-CD19+CD27+), 106 cells/L	116,3 (112,3-123,5)	269,3 (244,6-330,5)*	272,6 (242,3-312,4)*
Общее количество В-лимфоцитов, негативное по CD27 (не клетки памяти) (CD45+CD3-CD19+CD27-), 106 кл/л Total B cell count, negative for CD27 (not memory cells) (CD45+CD3-CD19+CD27-), 106 cells/L	69,2 (58,3-75,2)	94,5 (71,7-110,2)	85,6 (68,9-108,4)
В-лимфоциты с фенотипом (CD45+CD3-CD19+CD5+CD27+), позитивные по CD27 (106 кл/л ) B-lymphocytes with a phenotype (CD45+CD3-CD19+CD5+CD27+), positive for CD27 (106 cells/L)	115,2 (112,5-126,8)	80,1 (64,2-98,3)*	89,5 (78,6-105,3)*
В-лимфоциты с фенотипом (CD45+CD3-CD19+CD5-CD27+), позитивные по CD27, 106 кл/л B-lymphocytes with phenotype (CD45+CD3-CD19+CD5-CD27+), positive for CD27, 106 cells/L	15,4 (11,2-18,6)	20,1 (17,8-24,1)	19,5 (17,6-22,5)
В-лимфоциты с фенотипом (CD 45+CD3-CD19+CD5+CD27-), негативные по CD27, 106 кл/л B lymphocytes with phenotype (CD 45+CD3-CD19+CD5+CD27-), negative for CD27, 106 cells/L	36,5 (34,5-42,6)	45,6 (38,4-52,3)	39,4 (35,4-42,9)
В-лимфоциты с фенотипом (CD45+CD3-CD19+CD5-CD27-), негативные по CD27, 106 кл/л B-lymphocytes with phenotype (CD45+CD3-CD19+CD5-CD27-), negative for CD27, 106 cells/L	74,6 (65,3-84,2)	68,3 (57,6-82,1)	77,4 (68,4-91,4)
IL-10 (пг/мл) IL-10 (pg/mL)	28,4 (23,6-34,2)	17,5 (15,4-22,4)*	15,2 (12,0-16,3)*

Примечание. Достоверность различий (р) – критерий Манна–Уитни; * – значимые различия с группой 1.

Note. Significance of differences (p), Mann–Whitney test; *, significant differences with group 1.

 

Относительно общей популяции В-лимфоцитов среди изучаемых групп значимых различий не зафиксировано. Однако известна взаимосвязь лимфопенических реакций с высоким уровнем стресс-медиаторов и стероидных гормонов в крови [1].

В группе ветеранов УСВО с ПТСР нами показан рост в крови клеток с фенотипом CD45⁺CD3^-CD19⁺CD5⁺ в сравнении с показателями 2-й и 3-й группы. В-лимфоциты, экспрессирующие CD5⁺ маркер, обнаружены в различных тканях человека и могут продуцировать в том числе аутоантитела, например против двуцепочечной ДНК, однако роль о функциональных возможностях данных клеток в развитии постстрессовых расстройстви недостаточно изучена [13]. Имеются экспериментальные данные о том, что CD5-экспрессирующие В-клетки относятся к субпопуляции B-1a переходных В-лимфоцитов, расположенных в тканях, выстилающих серозные полости. В человеческой популяции молекула CD5 может быть обнаружена на клеточной мембране переходных CD24⁺⁺⁺CD38⁺⁺B-клеток типа 1. Переходные В-клетки человека включают не только В-клетки переходных типов 1 и 2, но и отдельные анергические В-клетки 3-го типа, а также CD27⁺ В-клетки, продуцирующие IL-10. Переходные В-клетки дифференцированно регулируют пролиферацию CD4⁺Т-лимфоцитов и поляризацию в сторону Th1-эффекторных клеток [6]. Анализ субпопуляций В-лимфоцитов с маркерами клеток памяти показал значимое снижение в крови ветеранов УСВО общего количества В-лимфоцитов памяти (CD45⁺CD3^-CD19⁺CD27⁺), на фоне повышения концентрации клеток позитивных по CD5 и CD27 с фенотипом CD45⁺CD3^-CD19⁺CD5⁺CD27⁺. Относительно других представленных субпопуляций значимых различий не зафиксировано.

Во время созревания и развития клеток незрелые В-клетки из костного мозга попадают в систему кровообращения, а затем мигрируют в селезенку для завершения переходной дифференцировки В-клеток и, в конечном итоге, становятся наивными В-клетками. В-клетки на разных стадиях дифференцировки экспрессируют различные поверхностные маркеры, такие как В-клетки памяти, характеризующиеся экспрессией CD27 и В-клетки плазмы, экспрессирующие CD38 [15]. Небольшой процент наивных В-клеток может дифференцироваться в В-клетки памяти после активации антигеном [10]. IgD и IgM обычно совместно экспрессируются на поверхности наивных В-клеток на ранней стадии дифференцировки в В-клетки памяти и носят название В-клеток памяти без переключения [16]. Когда IgD и IgM на поверхности В-клеток с непереключаемой памятью трансформируются в IgG, IgA или IgE, они называются В-клетками с переключаемой памятью [10] и способны быстро распознавать и инициировать иммунный ответ при стимуляции сходными антигенами, а также реактивироваться для генерации короткоживущих плазматических бластов, которые в дальнейшем могут созревать в плазматические В-клетки [10]. Показано, что улучшение когнитивных функций у пациентов со стресс-индуцированными расстройствами и нейродегенеративными заболеваниями может быть связано с повышением уровня периферических наивных В-клеток и снижением уровня В-клеток памяти [10].

Отдельного внимания заслуживает маркер CD27, присутствующий как на поверхности основной популяции Т-лимфоцитов периферической крови, так и в различных субпопуляциях нормальной линии В-клеток человека. CD27-позитивнвые В-лимфоциты характеризуются следующими критериями: с точки зрения физических свойств CD27⁺В-клетки образуют популяцию с увеличенным размером клеток в сочетании со сниженной плотностью клеток; экспрессия CD27 тонзиллярными В-лимфоцитами положительно коррелирует с mIgA; маркер CD27 на В-клетках может быть избирательно индуцирован комбинацией золотистого стафилококка и IL-2; CD27⁺ В-лимфоциты экспрессируют высокие уровни адгезивных структур LFA-1 (CD11a), ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58) и CD44, что в целом свидетельствует о том, что CD27⁺В-клетки играют важнейшую роль в механизмах межклеточного взаимодействия.

Наличие фенотипического разнообразия В-лимфоцитов вносит значимый вклад в структуру сложных регуляторных взаимоотношений между В-клетками и Tregs. С одной стороны, Tregs подавляют гуморальный иммунитет путем ингибирования В-клеток, с другой стороны, В-клетки могут регулировать пролиферацию наивных CD4⁺Т-клеток путем презентации антигена и костимулирующих молекул, а также пролиферацию и функцию Tregs [14].

Показано, что недавно идентифицированное подмножество Tregs без экспрессии FoxP3, но также обладающих регуляторными свойствами, индуцируется наивными В-клетками и носит название Тreg-of-В-клетки. Treg-of-B-клетки выполняют свои функции в основном, посредством межклеточного контакта и обладают протекторными свойствами в отношении аутоагрессии [6].

IL-10, повышенный уровень которого мы зафиксировали в группе ветеранов УСВО, является определяющим функциональным признаком Bregs, но не является адекватным маркером для идентификации данных клеток. Фактически, Bregs мыши и человека не имеют надежных поверхностных маркеров или биомаркеров с ограниченным происхождением, сопоставимых с FoxP3 в Tregs, таким образом, иммунная регуляция Bregs остается неясной. В настоящее время, репортерные мыши eGFP, которые экспрессируют eGFP под контролем промотора IL-10, используются для идентификации Breg, продуцирующих IL-10 [11].

Ряд исследователей полагает, что Bregs могут находиться в реактивном состоянии и все В-клетки обладают потенциалом продуцировать IL-10 в определенных условиях [17]. Роль Bregs в аутоиммунитете не имеет ничего общего с выработкой аутоантител, но тесно связана с секрецией цитокинов, таких как IL-35, IL-10 и TGF-â. Экспрессия факторов транскрипции, таких как Blimp-1 и факторов, индуцируемых гипоксией (HIFs), повышена в Bregs. Blimp-1 подавляет экспрессию IL-10, в то время как Blimp-1 с активированным STAT3 усиливает IL-10 [18]. Кроме того, HIF, как критические факторы транскрипции, опосредующие метаболизм и функции иммунных клеток, контролируют экспрессию IL-10 в Breg [9]. Также известно, что Treg-of-В-клетки могут продуцировать высокие уровни IL- 10, который важен для подавления эффекторных Т-клеток [12].

Заключение

Таким образом, установленное нами фенотипическое разнообразие субпопуляций В-лимфоцитов у ветеранов с наличием посттравматического стрессового расстройства характеризуется повышением в циркуляции В-лимфоцитов с молекулами CD5 и CD27, на фоне общего снижения В-клеток памяти, что свидетельствует о возможной аутоиммунной направленности нейровоспалительных процессов на территории головного мозга, связанных как со стресс-индуцируемым повышением проницаемости гемато-энцефалического барьера, так и с необходимостью контроля за избыточной активацией иммунокомпетентных клеток.

About the authors

S. L. Pashnin

Chelyabinsk Regional Clinical Hospital

Email: davidova-ev.med@yandex.ru

Neurosurgeon, Honored Physician of the Russian Federation, Head, Department of Neurosurgery

Russian Federation, Chelyabinsk

E. V, Davydova

Chelyabinsk Regional Clinical Hospital; South Ural State Medical University

Author for correspondence.
Email: davidova-ev.med@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Associate Professor, Professor, Department of Medical Rehabilitation and Sports Medicine, Head, Department of Early Medical Rehabilitation

Russian Federation, Chelyabinsk; Chelyabinsk

References

Supplementary files