Experimental mouse model of pulmonary fibrosis induced by nebulized LPS administration

Full Text

Введение

Воспаление, экспериментально индуцированное в ответ на LPS, основного иммуногенного компонента стенки грамотрицательных бактерий, используется для изучения молекулярных механизмов протекающих реакций и служит упрощенной моделью острого повреждения легких. У мышей краткосрочные эффекты, наблюдаемые на фоне острого LPS-индуцированного воспаления легких, хорошо изучены, в то время как долговременные изменения недостаточно исследованы. Так, в одном исследовании было показано, что однократное введение LPS в виде аэрозоля приводит к воспалению дыхательных путей и ремоделированию легочной ткани с отложением коллагена через несколько недель [3]. Известно, что развитие легочного фиброза является последствием перенесенного острого и не разрешившегося в течение длительного времени воспаления легких [9]. Таким образом, поиск релевантной мышиной модели для понимания механизмов, лежащих в основе перехода от острого воспаления к фиброзу легких, остается весьма актуальной задачей.

Модель LPS-индуцированного воспаления легких с помощью аэрозоля лучше имитирует физиологичный процесс заражения воздушно-капельным путем. Однако, несмотря на преимущества этой модели, к которым относятся неинвазивность метода, способность одновременно индуцировать заболевание у большого количества животных, а также равномерное осаждение частиц с LPS по поверхности дыхательных путей, существует и ряд недостатков. Так, одним из ограничений модели является то, что слизистые других органов могут также подвергаться воздействию бактериальных компонентов, что может вызывать нежелательные системные воспалительные реакции [6]. В связи с этим возникает потребность в разработке улучшенной экспериментальной модели, заключающейся, например, в использовании более низкой дозы LPS для снижения потенциальных побочных эффектов.

В настоящей работе была оптимизирована ранее опубликованная модель воспаления легких, а также продемонстрированы наличие признаков легочного фиброза на более поздних стадиях как следствие острого повреждения легких, индуцированного путем однократного ингаляционного введения LPS.

Материалы и методы

Мыши

Мышей линии C57BL/6 в возрасте 6-9 недель содержали на базе Автономного экспериментально-биологического комплекса для временного размещения и исследования генетически модифицированных линий лабораторных мышей категории SPF при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение № 075-15-2019-1660). Все манипуляции с животными были выполнены в соответствии протоколом, утвержденным Комиссией по биоэтике ИМБ РАН (Протокол № 1 от 04.03.2024).

LPS-индуцированное воспаление легких

Острое воспаление легких у мышей индуцировали посредством введения LPS по раннее опубликованному протоколу с небольшими изменениями [3]. Мышей подвергали воздействию LPS с использованием пассивной ингаляционной установки с камерой (Aeroneb Lab Nebulizer, Kent Scientific Corporation). Индукцию острого воспаления дыхательных путей осуществляли посредством однократного ингаляционного введения 5 мл LPS в концентрации 2 мг/мл (LPS из E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich, США) до полного распыления раствора, а также 5 мл физраствора в качестве контроля (рис. 1А, см. 2-ю стр. обложки). В эксперименте участвовало три группы мышей: контрольная группа (через 24 ч после введения физраствора); группа мышей для определения кратковременных эффектов (через 24 ч после введения LPS); а также группа мышей для оценки развития фиброза (через 5 недель после введения LPS).

Цитофлуориметрический анализ

Для блокировки неспецифического связывания клетки окрашивали антителами к FcãR, используя анти-СD16/CD32 антитела, в течение 20 мин при 4 °C с последующим окрашиванием антителами к поверхностным маркерам: анти-CD45 (30-F11), анти-SiglecF (E50-2440), анти-CD11c (N418), анти-CD11b (M1/70), анти-Ly6G (1A8) в течение 20 мин при 4 °C. Для исключения мертвых клеток использовали Fixable ViabilityDye. Анализ проводили с помощью проточного цитометра FACSCanto II (BD Biosciences, США) и программного обеспечения FlowJo v. 10.

Измерение продукции TNF, IL-6 и IL-10

Цитокины в БАЛ анализировали методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов Mouse TNFalpha, IL-6, IL-10 ELISA Ready-SET-Go (Thermo Fisher Scientific, США) по протоколу производителя.

Измерение экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени

РНК образцов легких подвергали обратной транскрипции для синтеза кДНК с использованием набора для синтеза кДНК RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific, США). Измерение экспрессии генов проводили с использованием qPCRmix-HS SYBR (ЗАО «Евроген», Россия). Анализ экспрессии генов проводили с использованием 7500 Real Time PCR System Amplificator (Applied Biosystems, США) и следующего набора праймеров (табл. 1). Для определения относительной экспрессии генов применяли сравнительный метод 2^-ΔΔСt [8].

 

Таблица 1. Последовательности праймеров, использованных для ПЦР в реальном времени

Table 1. Nucleotide sequences of primers used for QRT-PCR analysis

Ген Gene	Последовательность Sequence
	Прямая Forward	Обратная Reverse
Actb	CTCCTGAGCGCAAGTACTCTGTG	TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCC
Tgfb1	CAACAATTCCTGGCGTTACCT	GGCTGATCCCGTTGATTTCC
Il13	CCTGGCTCTTGCTTGCCTT	GGTCTTGTGTGATGTTGCTCA
Col1a1	ACGCCATCAAGGTCTACTG	GTACTCGAACGGGAATCCA
Acta2	GGCACCACTCTTTCTATAACGAG	GCACAATACCAGTTGTACGTCC

 

Гистологический анализ срезов легких

Образцы легочной ткани фиксировали в 4%-ном формальдегиде, заключали в парафин и с помощью микротома Slee Cut 4055 делали срезы толщиной 5 мкм с последующем окрашиванием по Массону, используя стандартный протокол производителя (ООО «БиоВитрум», Россия). Анализ срезов проводили на конфокальном микроскопе Zeiss LSM 980.

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов проводили в программе GraphPad Prism 9 при помощи теста one-way ANOVA. Различия считали достоверными при * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns (non-significant) – нет разницы.

Результаты и обсуждение

LPS-индуцированное повреждение легких является одной из широко применяемых и хорошо воспроизводимых моделей острого воспаления, которое используется для изучения молекулярных и клеточных механизмов патогенеза заболевания и поиска оптимальных терапевтических подходов. При этом большая часть исследований посвящена изучению повреждений легких на острой фазе, в то время как работы по оценке долговременных изменений в легочной ткани встречаются крайне редко. В нашей работе используется модель острого воспаления дыхательных путей посредством однократного ингаляционного введения LPS (рис. 1А, см. 2-ю стр. обложки). Предложенная модель позволяет оценить наличие как кратковременных изменений, наблюдаемых во время острой фазы, так и долгосрочных последствий в ответ на LPS, характерных для фибропролиферативной фазы, во время которой развивается хроническое воспаление и фиброз. Так, ингаляционное введение LPS спустя сутки приводило к значительной инфильтрации нейтрофилов в БАЛ, что характерно для острой фазы воспаления, в то время как на 5-й неделе после воздействия LPS содержание нейтрофилов снижалось до уровня, характерного для наивного состояния (рис. 1Б, см. 2-ю стр. обложки). В то же время процентное содержание эозинофилов через 24 ч и 5 недель после введения LPS не изменялось (рис. 1Б, см. 2-ю стр. обложки). Известно, что острое воспаление дыхательных путей приводит к достоверной деплеции резидентных SiglecF⁺CD11c⁺ альвеолярных макрофагов [1]. Действительно, у мышей на фоне острого воспаления наблюдалось резкое снижение процентного содержания альвеолярных макрофагов в БАЛ по сравнению с контрольной группой (рис. 1Б, см. 2-ю стр. обложки). В то же время мыши на 5-й неделе после введения LPS демонстрировали повышенное процентное содержание альвеолярных макрофагов по сравнению с группой мышей через 24 ч после ингаляционного введения LPS (рис. 1Б, см. 2-ю стр. обложки). При этом на 5-й неделе не происходило восстановления пула альвеолярных макрофагов, сравнимого с контрольного группой, что может свидетельствовать о продолжающемся воспалении дыхательных путей при фибропролиферативной фазе (рис. 1Б, см. 2-ю стр. обложки). Кроме того, через 5 недель после введения LPS наблюдалось локальное увеличение продукции IL-6, но не TNF в БАЛ (рис. 1В, см. 2-ю стр. обложки). При этом продукция TNF и IL-6 в БАЛ между группами мышей через 24 ч после ингаляционного введения LPS и контрольной группой была статистически значимой (рис. 1В, см. 2-ю стр. обложки). Таким образом, в качестве долговременных изменений в легких, спустя 5 недель после однократного аэрозольного введения LPS, наблюдался повышенный уровень продукции IL-6 и нарушенное восполнение пула альвеолярных макрофагов в БАЛ, что свидетельствует о хроническом характере воспаления.

 

Рисунок 1. Воспалительный профиль в легких через 24 ч и 5 недель после однократного ингаляционного введения LPS

Примечание. А – схема эксперимента. Мышей линии C57BL/6 подвергали ингаляционному воздействию 5 мл LPS в концентрации 2 мг/мл до полного распыления раствора в течение 30 минут, а также 5 мл физраствора (0,9% NaCl) в качестве контроля. В эксперименте участвовало три группы мышей: контрольная группа (через 24 ч после введения физраствора); группа мышей для оценки кратковременных эффектов (через 24 ч после введения LPS); а также группа мышей для исследования долгосрочных эффектов (через 5 недель после введения LPS). Б – процентное содержание альвеолярных макрофагов (SiglecF⁺CD11c⁺), эозинофилов (SiglecF⁺CD11c^-) и нейтрофилов (Ly6G⁺CD11b⁺) от CD45⁺VD^- клеток в БАЛ, вызванное воздействием LPS. В – уровень продукции TNF и IL-6 (пг/мл) в БАЛ после аэрозольного введения LPS. Статистический анализ проведен с помощью one-way ANOVA теста, * – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001; **** – p < 0,0001; ns – нет разницы.

Figure 1. Lung inflammatory profile in 24 h and 5 weeks after a single inhalation of LPS

Note. A, scheme of the experiment. C57BL/6 mice were inhaled with 5 mL of LPS at a concentration of 2 mg/mL until the solution was completely nebulized for 30 min. Saline (0, 9% NaCl) was administered as a control. Three study groups were designed as follows: control group (24 h after saline administration), a group of mice for evaluation of short-term effects (24 h after LPS administration) and mice for evaluation of long-term effects (5 weeks after LPS injection). B, frequencies (%) of alveolar macrophages (SiglecF⁺CD11c⁺), neutrophils (Ly6G⁺CD11b⁺) and eosinophils (Siglec-F⁺CD11c⁻) gated on CD45⁺VD^- live cells in BALF caused by nebulized LPS. C, protein levels of TNF and IL-6 (pg/mL) in BALF after LPS administration. *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001; ns, non-significant (one-way ANOVA test was used).

 

Известно, что IL-10, будучи каноническим противовоспалительным цитокином, снижает выработку провоспалительных цитокинов, тем самым ингибируя воспаление. При этом имеются данные о вкладе IL-10 в возникновение и развитие фиброза легких. Так, у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом обнаружен высокий уровень продукции IL-10 в БАЛ, а мыши с полным удалением IL-10 не развивали фиброз, индуцированный диоксидом кремния или блеомицином [2, 7]. Нами было показано, что кратковременное ингаляционное введение LPS спустя 5 недель, но не через 24 ч приводит к повышенной продукции IL-10 в БАЛ (рис. 2А, см. 3-ю стр. обложки). Другой важный медиатор воспаления легких, TGF-â (трансформирующий фактор роста â), способствует выработке коллагена в легочной ткани, а также активирует дифференцировку фибробластов [4]. Было установлено, что однократное воздействие LPS в виде аэрозоля значительно увеличивало экспрессию Tgfb1 и Col1a1 в легких у мышей через 5 недель по сравнению с контрольной группой и мышами с острым воспалением (рис. 2Б, см. 3-ю стр. обложки). Повышенная экспрессия Tgfb1 в легких коррелировала с локальной повышенной продукцией IL-6 (рис. 1В, 2Б, см. 3-ю стр. обложки), что подтверждает значимость IL-6-индуцированной экспрессии TGF-â в трансдифференцировке фибробластов в миофибробласты [10]. Важно отметить, что TGF-â также может дифференцировать фибробласты в миофибробласты путем индукции экспрессии á-SMA (гладкомышечный актин á), кодирующегося геном Acta2, в то время как IL-13 напрямую регулирует продукцию коллагена и á-SMA в фибробластах [5]. В соответствии с этими ранее опубликованными результатами, в легких мышей через 5 недель после воздействия LPS наблюдалась повышенная экспрессия как Il13, так и Acta2 в сравнении с другими группами (рис. 2Б, см. 3-ю стр. обложки). При этом окрашивание образцов ткани легкого по Массону выявило отложение коллагена (интенсивное синее окрашивание) в легочной ткани у мышей через 5 недель после аэрозольного введения LPS (рис. 2В, см. 3-ю стр. обложки), что коррелировало с повышенной экспрессией Col1a1 в легких мышей спустя 5 недель (рис. 2Б, см. 3-ю стр. обложки). Важно отметить, что в используемой модели наблюдалось незначительное отложение коллагена, что может свидетельствовать лишь о начальной стадии фиброза. Предположительно, накопление большого количества коллагена требует более 5 недель после воздействия LPS. Суммируя вышеописанные результаты, было показано, что однократное ингаляционное введение LPS приводит спустя 5 недель к появлению типичных признаков фиброза легких, таких как увеличение продукции IL-10 и экспрессии медиаторов фиброза, таких как Tgfb1, Col1a1, Il13, Acta2, наряду с отложением коллагеновых волокон в легочной ткани.

 

Рисунок 2. Введение LPS в виде аэрозоля через 5 недель приводит к увеличению экспрессии ключевых медиаторов, ассоциированных с фиброзом

Примечание. А – уровень продукции IL-10 (пг/мл) в БАЛ после аэрозольного введения LPS. Б – уровень относительной экспрессии генов, ассоциированных с фиброзом (Tgfb1, Il13, Col1a1, Acta2) в тканях легких мышей через 24 ч и 5 недель после аэрозольного введения LPS. В – репрезентативное фото гистологического окрашивания методом Массона срезов легких мышей после воздействия LPS, а также физраствора в качестве контроля. Области интенсивного синего окрашивания демонстрируют наличие коллагена в легочной ткани. Увеличение 5× (Контроль), 10× (LPS 24 ч), 20× (LPS 5 недель). Статистический анализ проведен с помощью one-way ANOVA теста, * – p < 0,05; *** – p < 0,001; **** – p < 0,0001; ns – нет разницы.

Figure 2. 5 weeks after aerosolized LPS administration leads to increased expression of key mediators associated with fibrosis

Note. A, protein levels of IL-10 (pg/mL) in BALF after aerosolized LPS administration. B, quantitative RT-PCR analysis of fibrosis-associated genes (Tgfb1, Il13, Col1a1, Acta2), normalized to Actb in the lungs caused by nebulized LPS and saline. C, representative Masson’s trichrome stained lung tissue sections of mice exposed to LPS and saline as a control. Areas of intense blue staining demonstrate the presence of collagen in lung tissue. Original magnification 5× (control), 10× (LPS 24 h), 20× (LPS 5 weeks). One-way ANOVA test revealed: *, p < 0.05; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001; ns, non-significant.

 

Заключение

В работе показано, что однократное введение LPS в виде аэрозоля, используя ингаляционную установку Aeroneb Lab Nebulizer с камерой, приводит к развитию хронического воспаления, а также появлению типичных признаков фиброза, проявляющиеся в повышенной продукции IL- 10 в БАЛ, экспрессии Tgfb1, Col1a1, Il13, Acta2 и накоплении коллагена в легких. Использование небулайзера как ингаляционной формы доставки LPS представляет собой более физиологичную экспериментальную модель по сравнению с интерназальным введением, что позволит в будущем изучить механизмы развития фиброза на поздних стадиях острого повреждения легких и оптимизировать существующие терапевтические подходы.

About the authors

O. A. Namakanova

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: olga.namakanova@gmail.com

Junior Research Associate, Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine

Russian Federation, Moscow

E. O. Gubernatorova

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: olga.namakanova@gmail.com

Senior Research Associate, Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine

Russian Federation, Moscow

N. R. Chicherina

Sirius University of Science and Technology

Email: olga.namakanova@gmail.com

Master Student, Division of Immunobiology and Biomedicine

Russian Federation, Krasnodar Region

R. V. Zvartsev

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: olga.namakanova@gmail.com

Junior Research Associate, Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine

Russian Federation, Moscow

M. S. Drutskaya

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences; Sirius University of Science and Technology

Email: olga.namakanova@gmail.com

PhD, MD (Biology), Leading Research Associate, Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine; Associate Professor

Russian Federation, Moscow; Krasnodar Region

References

Supplementary files