The involvement of proinflammatory cytokines in the pathogenesis of audiogenic epilepsy

Full Text

Введение

Эпилепсия, по данным ВОЗ, затрагивает 0,8% населения Земли. Известно, что в основе лечения больных эпилепсией лежит фармакотерапия, однако 20-30% случаев этого заболевания относятся к фармакорезистентным. Моделирование судорожных состояний на животных перспективно для изучения особенностей формирования повышенной судорожной готовности мозга, которая имеет полигенную природу. К набору генетических элементов, у которых изменяется экспрессия при развитии судорог, в том числе и у животных с повышенной к ним предрасположенностью, относятся многие гены синтеза основных нейромедиаторов (в частности, ГАМК и глутамата), а также целых ряд генов, связанных с функцией ионных каналов мембраны нейрона. Существующие инвазивные методы индукции судорожных состояний (электросудорожные, травматические и химические воздействия), несмотря на их относительную простоту, не дают характеристики особенностей ЦНС в целом. Они регистрируют только судорожные феномены per se. Преимуществами неинвазивных, генетических моделей эпилепсии являются, в частности, стабильность проявления «судорожного фенотипа» и возможность неоднократной индукции судорог. Формирование генерализованных эпилептиформных припадков активно анализируется на линиях грызунов с аудиогенной эпилепсией, АЭ (крысы, мыши, хомяки), судорожные припадки которых стабильны по характеру и охарактеризованы по многим особенностям метаболизма мозга. Их использование дает возможность анализа состояния мозга этих животных не только как результат экспрессии судорог (как в инвазивных моделях), но также и в «фоне», т. е. без развития припадка. Одной из таких информативных моделей является линия крыс Крушинского–Молодкиной (КМ) с высокой генетически детерминированной предрасположенностью к АЭ. С 1947 года линия поддерживается на Биологическом факультете МГУ имени Ломоносова (кафедра высшей нервной деятельности, лаборатории физиологии и генетики поведения) в режиме строгого инбридинга (более чем 40 поколений селекции) [11].

У больных эпилепсией, а также в экспериментах с индукцией судорог у животных (т. е. на лабораторных моделях) отмечен ряд аномалий иммунных клеток и экспрессии цитокинов [15]. Это означает, что иммунным процессам и ассоциированным с ними воспалительным реакциям принадлежит определенная роль в эпилептогенезе. В активации иммунной системы и в развитии воспалительных реакций важная роль принадлежит цитокинам – гетерогенной группе полипептидных соединений, влияющих также на периферическую и центральную нервную систему. Считается, что изменения продукции цитокинов TNF, IL-1 и IL-6, а также других метаболитов связаны с вызванной судорогами гибелью клеток [15]. Во время эпилептогенеза происходят изменения в экспрессии и ряде других воспалительных и нейротрофических факторов. Во многих исследованиях показано, что в цереброспинальной жидкости при эпилепсии повышены уровни некоторых интерлейкинов. В частности, цитокины рассматривают как «вещества-медиаторы» спонтанных судорог у мышей [1]. В исследованиях эпилепсии наиболее часто анализируют содержание и экспрессию IL-1, IL-6 и TNFá. Уровни этих цитокинов изменяются при эпилепсии наиболее сильно, причем это показано для различных форм этого заболевания. Семейство интерлейкина-1 включает в себя 3 лиганда – IL- 1á, IL-1â и IL-1ra. В ЦНС человека в отсутствие судорог цитокины IL-1 обнаруживают низкий уровень. Концентрация IL-1â понижена в плазме больных эпилепсией, и после судорог мало отличается от контроля [10].

Развитие судорог в экспериментах сопровождается быстрым нарастанием экспрессии мРНК IL-1â и белка IL-1â в коре, гипоталамусе и гипофизе. При моделировании хронической эпилепсии, когда судороги индуцированы каиновой кислотой, экспрессия IL-1â в коре и гиппокампе повышена. В ряде работ на моделях эпилепсии у грызунов описан проконвульсивный эффект IL- 1â (например, при введении каиновой кислоты). У мышей-нокаутов по IL-1á, IL-1â или по IL-1ra заметных физиологических отклонений и нарушений развития не обнаруживается. В то же время введение IL-1â в гиппокамп усиливает и пролонгирует поведенческие и ЭЭГ-показатели судорог. Показано проэпилептическое действие высоких доз IL-1â, тогда как его низкие дозы обладают антиэпилептическим действием [13]. У крыс линии GAERS (модель височно-лобной эпилепсии) IL-1â участвует в развитии «лимбических» судорог. У крыс этой линии проявление ЭЭГ комплексов «пик-волна» связывают с продукцией IL-1â реактивными астроцитами в соматосенсорной коре [9].

IL-2 является одним из важнейших цитокинов, обеспечивающих иммунорегуляцию, обеспечивая активацию Т-лимфоцитов при запуске иммунного ответа. Известно, что прямое внутрижелудочковое введение IL-2 мышам линии DBA/2 приводило к аудиогенным и хемоиндуцированным судорогам. Однако у больных эпилепсией уровни IL-2 в плазме и церебро-спинальной жидкости во время острой стадии болезни изменены не были [7].

Показано также, что процессы генерации судорог связаны с экспрессией TNFá. Его содержание в разных отделах переднего мозга увеличивается после «киндлинга» (процесса провокации миоклонических судорог), вызванного электрической стимуляцией миндалины, а также при развитии status epilepticus. Введение в мозг TNFá ослабляло судороги у мышей, а выключение его рецепторов – усиливало [1]. «Двойственная» природа действия этого фактора в эпилептогенезе требует дальнейшего более подробного анализа.

Нейровоспаление довольно редко изучалось на экспериментальных моделях эпилепсии. В частности, показано, что у мышей-нокаутов по гену интерлейкина-6 (IL-6^-/^-) порог генерации судорог при максимальном электрошоке не отличается от мышей «дикого» типа, но при этом у нокаутов обнаруживаются аудиогенные судороги [3]. Более подробный анализ влияния этого фактора проводился in vitro, и было показано, что IL-6 может в значительной степени нивелировать эксайтотоксичность, опосредованную глутамат – и NMDA-рецепторами. У мышей IL-6-/- были достоверно повышены уровни аспартата в стволе и гиппокампе и понижены – в промежуточном мозге. Уровни глутамата были достоверно снижены, а уровни ГАМК снижены в мозжечке, промежуточном мозге и гиппокампе. Предполагается, что множественные различия в уровне нейроактивных аминокислот у мышей с этим КО могут быть причиной развития предрасположенности к АЭ. У предрасположенных к АЭ крыс линии WAR (выведенной, как и линия КМ из аутбредной линии Wistar, см. Garcia-Cairasco [5] в гиппокампе, нижнем двухолмии, стриатуме и коре уровни всех цитокинов (IL-1â, IL-6, TNFá) и BDNF в коре были повышены через 4 часа после звуковой стимуляции, в стриатуме при этом были повышены уровни IL-6 и TNFá, а уровень TNFá был повышен и в нижнем двухолмии [4].

Одновременно со свидетельствами участия системы нейровоспаления в эпилептогенезе появляются данные о влиянии дексаметазона (синтетический глюкокортикостероид) на генерацию судорог. Дексаметазон обладает противовоспалительным и иммуносупрессивным действием, в частности снижает активацию Т-хелперов и подавляет выработку провоспалительных цитокинов, в частности TNF, IL-1, IL-2 и других. Есть данные о терапевтическом эффекте дексаметазона в отношении больных рефрактерной формой эпилепсии. Так, введение дексаметазона вместе со стандартными противосудорожными препаратам приводило к прекращение судорог [12]. У крыс линии КМ длительное применение дексаметазона приводило к снижению интенсивности судорожных эпилептиформных припадков в ответ на звук. Однако необходимо отметить, что противосудорожный эффект хронического введения дексаметазона сопровождался гибелью части крыс КМ опытной группы, в то время как у крыс линии «0» гибели не зарегистрировано [14]. Эти и вышеприведенные данные свидетельствуют о перспективности анализа системы нейровоспаления у животных с разным уровнем предрасположенности к АЭ.

Материалы и методы

1. Экспериментальные животные

Животные содержались в стандартных условиях по 6 крыс в каждой пластиковой клетке (46 × 30 × 16 cм) со свободным доступом к корму и воде, а также естественным режимом «день-ночь». В качестве модели эпилепсии использовались крысы линии КМ (n = 20, самцы, возраст 4 мес.), контрольной группой – крысы линии «0» аналогичного возраста (n = 18). Крысы линии КМ характеризуются максимальной интенсивностью аудиогенных судорог (тонические судороги, балл «4»). Крысы линии «0» характеризуются отсутствием аудиогенных судорог в ответ на звуковые раздражители. Крысы опытной и контрольной группы были разделены на две подгруппы. В подгруппе 1 забор биоматериала для исследования проводился без звукового воздействия. В подгруппе 2 забор биоматериала осуществлялся через 4 часа после звукового воздействия.

Эксперименты проводились в соответствии с биоэтическими нормами, (заключение Комиссии по биоэтике МГУ имени М.В. Ломоносова от 12.03.2014).

2. Процедура тестирования АЭ

Тестирование животных проводится в частично звукоизолированной пластиковой камере, в которую подается звуковой сигнал интенсивностью 120 дБ, при этом вручную фиксируется латентный период начала припадка, его интенсивность, время наступления различных стадий и время «выхода из припадка». Для количественной оценки интенсивности припадков АЭ в лаборатории используется следующая пятибалльная шкала: «0» – отсутствие реакции в течение 90 действия звука; «1» – двигательное возбуждение, характеризующееся беспорядочным бегом и высокими прыжками; «2» – падение на брюшко и клонические судороги, «3» – падение на бок с резко выраженными клоническими судорогами конечностей, «4» – тонические судороги всей мускулатуры (полная «4») или только передних конечностей (4-) с дальнейшей экстензией конечностей и приостановкой дыхания.

3. Мультиплексный анализ

В качестве исследуемого биологического материала использовались ткани структур головного мозга, получаемые после эвтаназии животных. Из головного мозга животных выделяли дорсальный стриатум и ствол мозга (образцы хранились при температуре -80 °C). Гомогенизация проводилась в стеклянных гомогенизаторах, экстракционный раствор содержал 0,01 М фосфатно-солевого буфера, коктейль ингибиторов протеаз (Roche Diagnostics GmbH, Германия), 0,05% Tween 20. Экстракционный раствор добавляли к тканям из расчета 500 мкл на 100 мг ткани. Гомогенат тканей центрифугировали (3000 g, 10 мин, 4 °C) и собирали супернатанты. Концентрацию цитокинов определяли с помощью мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа согласно протоколу производителя (MILLIPLEX map Kit, Millipore Corporation, США). Результаты анализа оценивались на мультиплексном анализаторе Bio-Rad MAGPIX (Bio-Rad, США).

Статистический анализ

Использовалось программное обеспечение GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, США). Сравнение показателей проводилось с использованием критерия Краскела–Уоллиса с апостериорным критерием Данна.

Результаты и обсуждение

В нашем исследовании мы оценивали концентрации провоспалительных цитокинов IL-1á, IL- 1â, IL-2, IL-6 и TNFá в стволе мозга и стриатуме животных исследуемых групп. Концентрация IL-1á не была обнаружен в исследуемых образцах, вероятно, его концентрация была ниже уровня детекции используемого набора.

Межлинейные различия продукции цитокинов у крыс линий КМ и «0» в условиях «фона»

На первом этапе работы была проведена оценка уровней исследуемых цитокинов у экспериментальных животных без звукового воздействия. В дорсальном стриатуме содержание цитокинов IL-1â, IL-6 и TNFá было достоверно ниже у крыс линии KM по сравнению с линией «0» (рис. 1А, рис. 2Б и рис. 3A). Высокая вариабельность показателей концентрации IL-2, как для состояния мозга до, так и после звуковой экспозиции в тканях дорсального стриатума крыс линии «0» может быть причиной отсутствия детекции достоверных различий между исследуемыми генетическими группами. Более высокая концентрация IL-6 и TNFá в стриатуме у крыс лини «0» характерна для фонового состояния животных. В тканях ствола мозга мы не обнаружили различий в уровне содержания исследуемых цитокинов между животными разных линий. Данные по концентрации IL-2 и IL-6 в стволе мозга не представлены (концентрации были ниже порога детекции).

Изменения содержания цитокинов в структурах мозга крыс КМ и «0» после аудиогенной экспозиции

После действия звука (вызвавшего аудиогенные судороги) у крыс линии КМ концентрации IL-1â и IL-6 в дорсальном стриатуме были выше, чем до звукового воздействия (рис. 1А, Б). При этом в стволе мозга происходило снижение уровня IL-1â после судорог АЭ как у крыс КМ, так и у крыс линии «0» (рис. 1Б).

 

Рисунок 1. Концентрации IL-1â в тканях головного мозга крыс линий КМ и «0»: А – дорсальный стриатум, Б – ствол мозга

Примечание. Концентрации цитокинов в пг/мл представлены в виде Me (Q0,25-Q0,75). Фоновое состояние (белые столбцы) и через 4 ч после звукового воздействия (серые столбцы), различия статистически достоверны * – р < 0,05 и ** – p < 0,01.

Figure 1. IL-1â concentrations in the brain tissues of the KM and “0” strain rats: A, dorsal striatum; B, brain stem

Note. Cytokine concentrations in pg/ml are presented as Me (Q_0.25-Q_0.75). Background state (white columns) and 4 hours after sound exposure (gray columns). *, **, significant difference, p < 0.05 and 0.01, respectively.

 

Уровень IL-2 у крыс КМ до аудиогенного воздействия был ниже порога детекции, в то время как после судорог значительно повышался – вплоть до 14,01 пг/мл. В ткани стриатума уровень IL-2 крыс линии «0» имел тенденцию к повышению (p < 0,1) после аудиогенного воздействия (рис. 2А). Также у крыс линии «0» после действия звука детектируется понижение уровня IL-1â в стволе мозга (рис. 1Б), что аналогично показателю у КМ. У крыс линии КМ в стволе мозга после аудиогенных судорог регистрировался пониженный (на 23,44%) уровень TNFá (рис. 3Б).

 

Рисунок 2. Концентрации цитокинов в дорсальном стриатуме крыс линий КМ и «0»: А – IL-2 и Б – IL-6

Примечание. См. примечание к рисунку 1.

Figure 2. Dorsal striatum IL-2 1 I (A) and IL-6 (B) concentrations in rats of KM and “0” strain

Note. As for Figure 1.

 

Рисунок 3. Концентрации TNFá в тканях головного мозга крыс линий КМ и «0»: А – дорсальный стриатум, Б – ствол мозга

Примечание. См. примечание к рисунку 1.

Figure 3. Dorsal striatum (A) and brain stem (B) TNFá concentrations in rats of KM and “0” strain

Note. As for Figure 1.

 

Полученные в нашем исследовании данные сходны с существующими научными данными. Так, в спинномозговой жидкости больных эпилепсией, а также в ткани мозга у больных разными формами эпилепсии присутствует изменение цитокинового профиля, в частности отклонение IL-1â и его растворимого рецептора IL-1RI. Кроме того известно, что тонико-клонические судороги у человека сопровождаются увеличением продукции NGF, IL-1â и TNFá [10]. Далее, на мышиной модели спонтанных судорог цитокины рассматриваются как возможные медиаторы при развитии припадка. Наиболее часто рассматриваемыми цитокинами при эпилепсии являются IL-1, IL-6 и TNFá. Показано, что уровни этих цитокинов меняются в зависимости от типа судорог, индуцируемых у лабораторных животных [2]. IL-2 также рассматривается как возможный индуктор судорожной активности. Так, ведение IL-2 в мозговые желудочки мышам DBA/2 индуцировало аудиогенные и фармакологически вызванные судороги.

IL-6 является одним из ключевых провоспалительных цитокинов и обладает множественными эффектами, он вовлечен и в воспалительные реакции в центральной нервной системе. В литературе показано непосредственное участие IL-6 в процессе возникновения судорог.

С одной стороны, воспалительный процесс может запускать судорожную активность, например, при лихорадке, также и судороги сами по себе могут вызвать в головном мозге воспалительный процесс. Известный иммуносупрессор синтетический глюкокортикоид дексаметазон дает положительный терапевтический эффект у больных с рефлекторной формой эпилепсии. Показано, что его добавление к стандартной противосудорожной терапии способствует прекращение судорог. В экспериментах на крысах КМ хроническое введение дексаметазона вдвое снижало интенсивность аудиогенной эпилепсии, увеличивало латентный период судорог и переводило большую часть реакций в двухволновые. Появление тормозной «паузы» чаще всего указывает на снижение интенсивности судорог [14].

Детектируемые уровни IL-1â, IL-6 и TNFá могут обнаруживаться и в норме тканях мозга, при этом они влияют на развитие судорог при эпилепсии. Настоящая работа показывает, что у крыс линии КМ в дорсальном стриатуме уровень IL-1â, IL-6 и TNFá был ниже, чем у крыс линии «0». Можно предположить, что эти цитокины модулируют проявление судорог, но не вызывают судороги сами по себе. Учитывая, что генетический фон крыс линии «0» частично сходен с таковым в линии КМ, сниженные уровни про-воспалительных цитокинов у крыс КМ в сравнении с не предрасположенными к судорогам крысами, следует исследовать более подробно.

Определяемые уровни IL-1â, IL-6 и TNFá присутствуют в тканях головного мозга в норме, и они определенно влияют на эпилептогенез. Значимые отличия уровней IL-1â, IL-6 и TNFá в дорсальном стриатуме крыс линии КМ (пониженные в сравнении с линией контроля «0») могут свидетельствовать о том, что эти цитокины модулируют проявление судорог, не вызывая их непосредственно.

Уровни исследуемых цитокинов в дорсальном стриатуме, согласно нашим данным, аналогичны таковым в стволе мозга, однако, участие структур дорсального стриатума в АЭ недостаточно изучено. Изменение профиля цитокинов в стриатуме может свидетельствовать о возможной регуляторной роли этой структуры в реализации припадков рефлекторной эпилепсии. Таким образом, наша работа дает определенное подтверждение вовлеченности структур дорсального стриатума в патогенез аудиогенных судорог. Полученные данные показывают, что развитие припадка АЭ у крыс линии КМ сопровождалось гиперпродукцией IL-1â и IL-6 в данной структуре мозга. Уровни IL-6 и IL-1â в стриатуме у крыс линии «0» (после действия звука в отсутствие АЭ) не отличались от значений у животных этой линии до припадка. Можно предположить, что развитие аудиогенного припадка может вовлекать клетки глии, часть из которых может рассматриваться как клетки врожденного иммунитета и активные продуценты провоспалительных цитокинов, в том числе исследуемых в настоящей работе. Нервно-глиальные взаимодействия в настоящее время изучены недостаточно, однако существуют данные, позволяющие говорить о возможности активации клеток глии за счет передачи нервного импульса. Интересным для нас также является, то, что уровень IL-1â в стволе мозга у крыс линии «0» после звукового воздействия был ниже, чем до воздействия, как и у крыс линии КМ, это может говорить о латентном воздействии звука на уровни провоспалительных цитокинов в тканях мозга. Также это может выявлять скрытую предрасположенность к АЭ, которая действительно существует, так как известно, что введение низких дозы коразола позволяют индуцировать АЭ даже таких животных [6]. Еще одним важным результатом нашей работы можно считать выявление участия TNFá в развитии судорог АЭ, поскольку вовлеченность данного провоспалительного цитокина не описана ранее и впервые выявлена в данной работе.

Заключение

Роль нейровоспаления в развитии судорожных состояний хотя и неоспорима, однако механизмы, лежащие в основе взаимодействия между нервной системой и клетками глии, обладающими иммунными функциями, требуют дальнейшего изучения. Полученные в данной работе данные позволяют дополнить информацию о существующих лабораторных моделях эпилепсии, а также их особенностях на биохимическом уровне. Большинство современных противоэпилептических и противосудорожных препаратов имеют мишенью разные звенья нейротрансмиттерных систем мозга (ГАМК-, глутаматергические, моноаминергические и др.). В то же время существуют множественные клинические и экспериментальные свидетельства участия в развитии судорог разного генеза про- и противовоспалительных систем мозга, однако эти данные мало используются в нейрофармакологии. Линия КМ является известной моделью с высокой предрасположенностью к АЭ, а животные линии «0», по сути, являются контрольной группой к ним, т. е. генетически близкими животными без предрасположенности к эпилепсии, таким образом, можно использовать эти линии в качестве экспериментальной модели для изучения нейровоспаления. Полученные данные расширят представления о возможности применения противовоспалительных и иммунных препаратов для противосудорожной терапии и позволят оценить возможные побочные эффекты их возможного применения при терапии судорог.

About the authors

N. M. Surina

Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: Opera_ghost@inbox.ru

PhD (Biology), Senior Research Associate, Biology Department

Russian Federation, Moscow

I. B. Fedotova

Lomonosov Moscow State University

Email: Opera_ghost@inbox.ru

PhD (Biology), Senior Research Associate, Biology Department

Russian Federation, Moscow

I. I. Poletaeva

Lomonosov Moscow State University

Email: Opera_ghost@inbox.ru

PhD, MD (Biology), Leading Research Associate, Biology Department

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files