Methodological approaches to the comparative assessment of cellular reactions of innate immunity in mollusk Pomacea sp. (Caenogastropoda, Ampullariidae) in experimental aseptic inflammation

Full Text

Исследования проводились в рамках государственного задания «ИЭГМ УрО РАН» по теме: «Изучение механизмов регуляции клеток иммунной системы и разработка методов их оценки в норме и патологии», номер 124020500027-7.

Введение

Несмотря на то, что с открытия И.И. Мечниковым явления фагоцитоза в 1882 г. в эксперименте на личинках морской звезды и формулировки им основных положений сравнительной патологии воспаления в 1892 г. [2] прошло много лет, проблемам сравнительной патологии уделяется недостаточно много внимания. В первой своей лекции И.И. Мечников писал: «Должна возникнуть отрасль общей зоологии, т. е. сравнительная патология животных, которая будет во многих отношениях отличаться от ныне существующей сравнительной патологии. В то время как эта последняя, основанная, главным образом, ветеринарами, применяется исключительно к высшим животным, а именно к позвоночным, настоящая сравнительная патология должна обнимать весь животный мир в его целом и изучать·его с самой общей биологической точки зрения» (цит. по [2], С. 3). В связи с открытием в 1995-1998 гг. сходных по структуре распознающего домена сигнальных паттернраспознающих рецепторов (англ. Pattern Recognition Receptors, PRRs) у растений [15], беспозвоночных [11] и позвоночных [12, 13] животных и присуждением в 2011 г. за это открытие Нобелевской и других престижных премий, интерес к сравнительному исследованию реакций врожденного иммунитета значительно повысился. Наиболее важные исторические вехи в развитии сравнительной иммунологии и ключевые работы в этой области выделены одним из ее современных основоположников Эдвином Л. Купером [5]. Одна из существенных методических проблем, возникающих при исследовании клеток врожденного иммунитета беспозвоночных животных, – непригодность культуральных сред и даже солевых растворов, предназначенных для млекопитающих и человека, так как даже для близких представителей беспозвоночных растворы, идентичные циркулирующей жидкости, имеют разный состав. Другой важный методический момент – значительно выраженные реакции коагуляции (аналог системы коагуляционного гемостаза млекопитающих), клеточной агрегации и дегрануляции, играющие важнейшую защитную роль у всех беспозвоночных животных [10], но проявляющиеся in vitro в клеточных суспензиях, приготовленных даже на оптимальных для данного животного солевых растворах. Для решения этой проблемы современные исследователи широко используют даже при исследовании фагоцитоза антикоагуляционный буфер с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) [6, 7, 14]. С позиций традиционных подходов иммунологии млекопитающих использование ЭДТА возможно только для исследования морфологии клеток, но не их функций. Учитывая важную роль внутриклеточного кальция в сигнальных активационных путях, не удивительно, что ЭДТА угнетает функции фагоцитирующих клеток, в частности – продукцию ими активных форм кислорода [9]. В последние годы увеличивается число экспериментальных иммунологических, фармакологических, физиологических исследований, выполняемых на нетрадиционных экзотических животных, к которым в частности относятся водные позвоночные и беспозвоночные животные, хорошо культивирумые в аквариуме в лабораторных условиях [8].

Цель работы – адаптация методических подходов к сравнительной оценке клеточных реакций врожденного иммунитета у моллюсков Pomacea sp. (Caenogastropoda, Ampullariidae) при экспериментальном асептическом воспалении.

Материалы и методы

Моллюсков Pomacea sp. (Caenogastropoda, Ampullariidae) содержали в аквариуме объемом 100 л при температуре 24-26 °C со световым режимом 12 ч света и 12 ч темноты. Их кормили 1 раз в сутки в начале светового дня сбалансированным кормом Tetra ReptoMin (Tetra GmbH, Германия).

В качестве объекта для сравнительного исследования использовали неинбедных белых крыс 2-6 месячного возраста, которых содержали в условиях вивария на стандартной диете (со свободным доступом к пище и воде) и стандартном освещении (12 ч света и 12 ч темноты). Все исследования одобрены на соответствие нормам биомедицинской этики этическим комитетом при «ИЭГМ УрО РАН», протокол № 3 от 30.11.2015 г.

С учетом особенностей беспозвоночных животных всю работу проводили с использованием изотонического для клеток гемолимфы моллюсков Pomacea sp. полного солевого раствора (ПСР) следующего состава: 43 мМ NaCl, 1,8 мМ KCl, 4,25 мМ CaCl₂, 1,87 мМ MgCl₂, 5,5 мМ глюкоза, 10 мМ HEPES, pH = 7,6. Состав ПСР мы выбрали на основании опубликованных работ по биохимическому составу и физико-химическим свойствам гемолимфы моллюсков Pomacea canaliculata [6]. Для предотвращения коагуляции и агрегации клеток во всех исследованиях in vitro к ПСР ex tempore добавляли гепарина натриевую соль в концентрации 100 ЕД/мл (далее сокр. – ПСР-геп). В предварительном эксперименте проводили оценку возможного влияния гепарина на продукцию активных форм кислорода фагоцитирующими клетками костного мозга крыс в реакции люминолзависимой хемилюминисценции. Для остановки фагоцитоза помимо помещения суспензий на лед использовали антикоагуляционный буферный раствор следующего состава: 43 мМ NaCl, 1,8 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 30 мМ ЭДТА; pH 7,6 (далее сокр. – АКБ-ЭДТА) [7, 14].

В отдельном эксперименте оценивали жизнеспособность и апоптоз клеток гемолимфы в условиях их инкубации при температуре 28 °C (опыт) и 4 °C (контроль) в течение 60 и 180 мин в ПСР-геп. или в АКБ-ЭДТА. Для оценки апоптоза клеток гемолимфы методом проточной лазерной цитометрии использовали набор реактивов BD PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen™). В 96-луночном планшете к 10 мкл клеток в концентрации 10⁶/мл добавляли 0,5 мкл аннексина V-PE (PE Annexin V) и 0,5 мкл 7-аминоактиномицина D (7-AAD) в рабочих концентрациях, инкубировали 20 мин в темноте при комнатной температуре, добавляли по 180 мкл АКБ-ЭДТА в каждую лунку, перемешивали и сразу же анализировали результаты на проточном лазерном цитометре. Анализ проводили в модулях Guava Nexin Assay и Guava ExpressPro Assay программного обеспечения Millipore CytoSoft 5.3 для проточного цитометра Guava EasyCyte (Millipore) по инструкции производителя. Параллельно оценивали целостность наружных клеточных мембран с помощью теста с трипановым синим и аппарата клеточного анализа Cellometer^TM Auto T4 Cell Counter (Nexcellom Bioscience LLC). Клеточную суспензию разводили 1/10 холодным АКБ-ЭДТА и к 3 частям полученной суспензии добавляли на холоду 1 часть 0,4% изотонического раствора трипанового синего, приготовленного на АКБ-ЭДТА. Число жизнеспособных (неокрашенных) и погибших (окрашенных) клеток просчитывали с помощью программного обеспечения к прибору.

Для индукции асептического воспаления моллюскам проводили анестезию по методу [7] и вводили стерильную суспензию зимозана А (Zymosan A from Saсcharomyces cerevisiae, Sigma, Z4250) внутримышечно в подошвенную область ноги в дозе 0,5 мг/10 г массы тела [3]. Животных выводили из эксперимента через 12 ч после инъекции флогогена. Контролем служили животные, которым вместо зимозана вводили эквивалентное количество ПСР. После анестезии и обездвиживания моллюска по методу [7] с помощью шприца забирали гемолимфу в пробирку эппендорф с гепарином (100 ЕД/мл), извлекали орган кроветворения (почка) и ткани в области инъекции флогогена, которые помещали в пробирки, содержащие ПСР-геп. Суспензию клеток из выделенных органов получали общепринятым методом гомогенизации в пробирках эппендорф в ПСР-геп в объеме до 1,0 мл с помощью стерильного полипропиленового пестика (Tissue Grinder, Axygen^®). После подсчета исходного числа ядросодержащих клеток (ЯСК) в камере Нейбауэра (AC1000 Improved Neubauer, Hawksley, Великобритания) их отмывали центрифугированием и доводили их концентрацию до 25 × 10⁶ ЯСК/мл. Показатели лейкоформулы оценивали традиционным микроскопическим методом с комбинированной окраской препаратов по Романовскому–Гимзе с докрашиванием эозином-метитиленовым синим по Лейшману при pH 7,4. Для оценки фагоцитарной активности лейкоцитов и ацидификации фагосом использовали частицы зимозана, меченого pH-сенситивным флуорохромом зеленым pHrodo^TM (pHrodo™ Green Zymosan Bioparticles™ Conjugate for Phagocytosis, Thermo Fisher Scientific, P35365). В микропробирках эппендорф объемом 0,2 мл смешивали 4 мкл частиц (100 × 10⁶ частиц/мл) и 4 мкл аутоплазмы гемолимфы, после инкубации смеси при 28 °C в течение 30 мин для опсонизации добавляли 4 мкл суспензии лейкоцитов (25 × 10⁶ клеток/мл) и 88 мкл ПСР-геп. После инкубации в течение 120 мин при 28 °C пробирки помещали на лед и их содержимое количественно переносили в плоскодонные 96-луночные планшеты (АО «Медполимер», Россия), используя для отмывания и увеличения объема каждой пробы по 100 мкл охлажденного до 4 °C АКБ-ЭДТА с pH = 7,6. Общий объем каждой пробы был равен 200 мкл, что необходимо для просчета на цитометре абсолютного числа клеток и событий. Анализ интенсивности флуоресценции проводили с помощью планшетного проточного лазерного цитофлуориметра Guava EasyCyte (Hayward, CA, США), который позволяет непосредственно оценить абсолютное количество клеток на микролитр без использования эталонных частиц, благодаря применению стандартизированного микрокапилляра и высокоточного микронасоса (The Lee Company, США). Далее данные анализировали в программе Guava CytoSoft 5.3, где в модулях Guava ExpressPlus и Guava Express PRO проводили последовательное гейтирование гистограмм, полученных с датчика переднего светорассеяния (Forward Scatter) по количеству флуоресцентых событий по датчику Green Fluorescence. При этом все отгейтированные клетки объективно отражают уровень ацидификации фагосом, так как при физиологических значениях pH вне клетки green pHrodo^TM не флуоресцирует, и интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна снижению pH до 4,0-4,5 при ацидификации фагосом. Результаты выражали в виде числа флуоресцирующих событий, которое отражает общее число клеток с ацидифицированными фагосомами. Параллельно проводили оценку фагоцитоза немеченых частиц зимозана традиционным микроскопическим методом, при этом время инкубации клеток с объектами фагоцитоза составляло 30 мин при 28 °C.

Кислородзависимую микробицидность фагоцитирующих клеток оценивали методом люминолзависимой хемилюминесценции. В стимулированном варианте в лунке планшета (3912 Corning^® 96-well White Flat Bottom Polystyrene Microplate, Corning Inc. Costar) смешивали 70 мкл ПСР-геп., 10 мкл натриевой соли люминола (Luminol sodium salt, Sigma, США, A4686-1G) на ПСР-геп. (конечная концентрация 2 × 10^-4 M), 10 мкл лейкоцитов (25 × 10⁶/мл) и 10 мкл опсонизированного или неопсонизированного зимозана (конечные концентрации 15, 150 и 1500 мкг/ мл). В спонтанном варианте смешивали те же компоненты, но вместо зимозана вносили 10 мкл ПСР-геп. Измерение проводили на люминометре Luminoskan Ascent^® Thermo Labsystems (тип измерения – kinetic, integration time – 1000 ms, интервал – 3 мин, meas. count – 60) в течение 180 мин. Для статистического анализа использовали интегральный показатель хемилюминесценции за весь период измерения (integral, RLU).

Для сравнительного исследования использовали модель 12-часового зимозанового перитонита у крыс, индуцированного внутрибрюшинным введением стерильной суспензии зимозана в дозе 50 мг/кг по ранее детально описанным методам [3].

Статистический анализ проводили с помощью методов описательной статистики. Результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±m).

Результаты и обсуждение

Установлено, что после инкубации при 28 °C в течение 60 и 180 мин число жизнеспособных, т. е. PE Annexin V^–7-AAD^– не отличается от контроля без преинкубации и с инкубацией клеток при 4 °C и составляет в среднем 97,2%. Относительное число клеток с неповрежденной клеточной мембраной и не окрашивающихся трипановым синим составляет после самой длительной инкубации 98,1%. Таким образом, при использовании ПСР с добавлением 100 ЕД/мл натриевой соли гепарина жинеспособность клеток сохраняется высокой.

Исследование влияния натриевой соли гепарина в концентрации 100 ЕД/мл на кислородзависимую микробицидность фагоцитирующих клеток в реакции люминолзависимой хемилюминисценции (ЛЗХЛ) провели с клетками костного мозга самцов крыс. Контролем служили пробы с добавлением вместо гепарина раствора Хенкса. Гепарин вносили в момент постановки реакции ЛЗХЛ. Установлено, что гепарин в исследованной концентрации статистически значимо не влияет на интегральные показатели хемилюминисценции (Integral RLU) при оценке различий по t-критерию Стьюдента для парных данных. Показатели Integral RLU для проб с гепарином и без него соответственно составили: в лунках без зимозана 35,793±13,906 и 24,390±1,352; в пробах с добавлением 15 мкг/мл опсонизированного зимозана 1415,000±266,856 и 1569,333±273,271; при концентрации опсонизированного зимозана 150 мкг/мл 2707,667±172,853 и 4207,000±952,392; при концентрации опсонизированного зимозана 1500 мкг/мл 4724,333±1465,999 и 6198,333±2195,182. Таким образом, натриевая соль гепарина в концентрации 100 ЕД/мл не влияет на показатели реакции люминолзависимой хемилюминисценции и поэтому использование гепарина в качестве антикоагулянта, предотвращающего коагуляцию, агрегацию и дегрануляцию клеток предпочтительнее, чем использование ЭДТА, так как последний оказывает выраженный угнетающий эффект на функции фагоцитирующих клеток [9].

C использованием ПСР-геп мы исследовали поглотительную активность и ацидификацию фагосом лейкоцитов гемолимфы, органа кроветворения (почки) и очага воспаления, индуцированного внутримышечным введением стерильной суспензии зимозана. Как видно из рисунка 1, в очаге воспаления увеличивается ацидификация фагосом, сопровождающаяся вследствие снижения pH увеличением числа флуоресцирующих зеленым цветом клеток, поглотивших меченые pHrodo^TM объекты фагоцитоза.

 

Рисунок 1. Распределение флуоресцирующих событий по боковому (SSC) и прямому (FSC) светорассеянию после гейтирования по интенсивности зеленой флуоресценции при исследовании клеток очага воспаления

Примечание. Слева – моллюск контрольной группы. Справа – моллюск опытной группы с воспалением.

Figure 1. Distribution of fluorescent events by side (SSC) and forward (FSC) scatter after gating according to the intensity of green fluorescence in the study of cells from inflammatory focus

Note. On the left is a mollusk of the control group. On the right is a mollusk of the experimental group with inflammation.

 

В отличие от моллюсков Lymnaea stagnalis и Biomphalaria glabrata, у которых давно хорошо документирована продукция активных форм кислорода фагоцитами в реакции люминолзависимой хемилюминисценции [4], мы не смогли индуцировать эту реакцию у моллюсков Pomacea sp. даже в условиях увеличения концентрации люминола и числа лейкоцитов в сравнении со стандартными условиями проведения реакции. Уровень люминисценции статистически значимо не отличался от показателей фона. Отсутствие люминисценции может быть связано с отсутствием у моллюсков компонентов НАДФH-оксидазного комплекса. Отсутствие реакции ЛЗХЛ отмечено и у насекомых [1], и для детекции активных метаболитов кислорода авторы предлагают использовать более чувствительный чем ЛЗХЛ метод спиновых ловушек. Этим методом авторы установили, что активные формы кислорода могут быть образованы в незначительном количестве в течение фенолоксидазного каскада реакций, конечным итогом которого является образование меланина и меланизация гемолимфы насекомых.

Заключение

Таким образом, результаты проведенной работы подтверждают существование у беспозвоночных животных многообразия вариантов эффекторных механизмов клеточных реакций врожденного иммунитета даже на примере брюхоногих моллюсков, что нуждается в дальнейших исследованиях.

About the authors

K. A. Khrushchev

Perm State University

Email: jshilov@mail.ru

4^th year Student, Biological Faculty

Russian Federation, Perm

S. Yu. Shilov

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; E. Wagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: jshilov@mail.ru

PhD (Medicine), Junior Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology, Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; Associate Professor, Department of Normal Physiology, E. Wagner Perm State Medical University

Russian Federation, 3 Golev St, Perm, 614081; Perm

S. Yu. Barkov

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; E. Wagner Perm State Medical University

Email: jshilov@mail.ru

Postgraduate Student, Laboratory of Ecological Immunology, Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; Senior Laboratory Assistant, Department of Immunology, E. Wagner Perm State Medical University

Russian Federation, 13 Golev St, Perm, 614081; Perm

Yu. I. Shilov

Perm State University; Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; E. Wagner Perm State Medical University

Email: jshilov@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Senior Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology, Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; Associate Professor, Department of Immunology, E. Wagner Perm State Medical University, Perm, Russian Federation; Associate Professor, Department of Microbiology and Immunology, Perm State University

Russian Federation, Perm; 13 Golev St, Perm, 614081; Perm

References

Supplementary files