Proinflammatory cytokines, chemokine CXCL17 and heat shock proteins in osteoarthritis of the knee joint

Full Text

Введение

Распространенное заболевание опорно-двигательного аппарата остеоартрит (ОА) относится к ведущей причине инвалидности населения. Это многофакторное заболевание со сложным патогенезом поражает преимущественно коленный сустав (около 16%), чаще женщин, и его распространенность связана с высокими показателями ожирения и средней продолжительности жизни [6]. Одним из наиболее важных факторов патогенеза ОА является нарушение баланса цитокинов в сторону провоспалительных, повышение уровня которых приводит к дисфункции клеток хрящевой ткани с ее повреждением, а также других внутрисуставных структур за счет активации катаболических ферментов (матриксные металлопротеиназы и дезинтегрин-подобная металлопротеиназа с тромбоспондиновым мотивом, ММП и ADAMTS) [8]. Показано, что наиболее важными медиаторами воспаления в патогенезе ОА являются интерлейкины IL-1β и IL-6, фактор некроза опухоли (TNFá) и хемокины. Последние индуцируют появление в синовиальной жидкости сустава иммунных клеток с преобладанием тканевых макрофагов синовиальной оболочки и субхондральной кости и T-лимфоцитов, что в дальнейшем способствует секреции воспалительных факторов и прогрессированию заболевания [10]. Так, хемокин CXCL17 индуцирует активность макрофагов и ферментов ММП при ингибирующем воздействии на синтез коллагена, что позволяет предположить его участие в иммунных механизмах остеоартрита и сосудистого ремоделирования [10].

Активация клеток при воздействии IL-1β опосредуется через специфический рецептор первого типа (IL-1RI), экспрессия которого повышается на хондроцитах и синовиальных фибробластах при ОА [1, 12]. TNFá связывается с двумя специфическими рецепторами на клеточной мембране TNFRI (или p55) и TNFRII (или p75) на этих клетках, и их экспрессия также повышается при ОА [2]. Указывается, что доминантным рецептором на клетках суставной ткани, ответственным за опосредованное действие цитокинов, является TNFRI, но и рецептор TNFRII также принимает участие в сигнальной трансдукции, что связано с различными внутриклеточными каскадами белков [8]. Природная толерантность хондроцитов к действию провоспалительных цитокинов опосредуется системой шаперонов (белки теплового шока, HSP). Так, низкомолекулярный шаперон с молекулярной массой 27 кДа (HSP27) действует как антиоксидант и играет роль в ингибировании апоптоза, тогда как высокомолекулярный HSP70 активируется под влиянием цитокинов и, напротив, запускает апоптоз клеток [7]. Несмотря на приведенные литературные данные, вопрос об участии межмолекулярных посредников в развертывании иммунного ответа при ОА остается открытым. Цель нашего исследования состояла в изучении диагностической значимости показателей содержания наиболее важных цитокинов и хемокинов, участвующих в патогенезе ОА.

Материалы и методы

Исследовали 50 пациентов, находящихся на стационарном лечении в КГБУЗ «Госпиталь для ветеранов войн» (г. Владивосток). Диагноз «ОА коленных суставов» устанавливали на основании классификационных критериев ACR (American College of Rheumatology) в соответствии с «Клиническими рекомендациями по диагностике и лечению остеоартрита» ассоциации ревматологов России Российского научного медицинского общества терапевтов. Группу сравнения составили лица без ОА, сопоставимые по полу и возрасту основной группы. Критерии включения в исследование: диагноз «ОА», соответствующий критериям ACR, мужчины и женщины в возрасте от 45 до 80 лет. Критерии исключения из исследования: отсутствие информированного согласия пациента, травмы суставов и/или длительная иммобилизация в период 24 месяца до включения в исследование, переломы мыщелков бедренных и проксимального отдела большеберцовых костей любой давности, системные заболевания соединительной ткани, сахарный диабет 1-го типа, микрокристаллические артропатии, онкологические заболевания, соматические заболевания в стадии декомпенсации, наличие противопоказаний к диагностическим процедурам, предусмотренным протоколом данного исследования. Все участники, включенные в исследование, проведенном в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации и одобренном Междисциплинарным комитетом по этике ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава (протокол № 2 от 12.11.2023 г.), подписали форму информированного согласия. Рентгенологическую стадию оценивали согласно классификации Kellgren: у 14 (27,3%) больных была I, у 26 (51,5%) – II и у 10 (21,2%) – III стадия ОА.

Образцы крови (5 мл) собирали в контролируемых условиях (без голодания, с 8 до 9 утра), после центрифугирования (3000 × g об/мин, 10 мин) аликвоты сывороток удаляли и хранили при -20°C до начала анализа. Образцы сыворотки идентифицировались случайными числами, а демографические и клинические данные сопоставлялись с одним и тем же идентификационным номером. Перед анализом образцы сыворотки оттаивали при комнатной температуре и медленно перемешивали. Концентрацию IL-1β, IL-6, CXCL17 и TNFá в сыворотке измеряли с помощью сэндвич-ферментного иммуноферментного анализа (высокочувствительные наборы ELISA для определения IL-1β, IL-6, TNF, Chemokine (C-X-C Motif) Ligand 17 человека Cloud-Clone Corp., США) и белки теплового шока HSP27 и HSP70 (ELISA, SunLong Biotech Co., LTD, КНР). Анализы проводились согласно инструкциям производителя. В соответствии с этим стандартная кривая для каждого биомаркера была построена на основе средней абсорбции конкретных стандартных разведений, выполненных в двух экземплярах, и их соответствующих концентраций. Поглощение при длине волны 450 нм определяли с помощью микропланшетного ридера (анализатор iMark, Bio-Rad, США). Концентрации белков считывали по стандартным кривым, средние коэффициенты вариации внутри и между анализами составляли < 10% для всех биомаркеров.

Анализ данных проводили с использованием Statistica версии 14.0. (TIBCO Software Inc., США). Категориальные данные сравнивались с критерием ÷-квадрат Пирсона. Нормальность количественных данных проверялась с помощью теста Колмогорова–Смирнова, который показал, что распределение не было нормальным. Количественные данные представлены в виде медианы и диапазона. U-критерий Манна–Уитни и тесты ANOVA Краскела–Уоллиса использовались для проверки различий между количественными переменными. После ANOVA мы использовали апостериорный тест Шеффе. значения p ниже 0,05 считались статистически значимыми.

Результаты и обсуждение

Всего было обследовано 50 пациентов в возрасте от 52 до 78 лет (в среднем 63 года), большинство составляли женщины (74%), и в целом все участники имели слегка избыточный вес (ИМТ 27,0 кг/м²), боль в коленях преобладала у 45% испытуемых. Показатели содержания цитокинов IL-1β, IL-6, хемокина CXCL17 и TNFα в сыворотке крови больных ОА составили 7,4 (6,4- 8,9), 33,7 (26,5-68,4), 33,8 (29,8-61,0) и 6,5 (4,94- 8,59) пг/мл соответственно, что достоверно превышало значения для здоровых лиц (1,3 (1,2- 1,4), 5,8 (4,2-6,3), 24,9 (19,1-29,9) и 2,7 (2,1-3,1) пг/мл) (рис. 1, p < 0,05). Не было выявлено существенных различий между субъектами с высоким (≥ медианным) и низким (< медианным) уровнем IL-6 с точки зрения пола, ИМТ, курения, статуса заболевания. Пациенты с высоким уровнем IL-6 (≥ медиана) были старше и имели более высокие уровни TNFα. Согласно рентгенологическому обследованию, пациенты были разделены на три группы в зависимости от стадии заболевания. Как показано на рисунке 1, содержание IL-1β, TNFα и хемокина CXCL17 у больных ОА на различных стадиях достоверно не отличалось. Тогда как количество IL-6 у пациентов при I и II стадиях превышало показатели при III и составило 36,3 (35,4-40,4), 33,6 (31,9-35,4) и 30,1 (26,6-31,2) соответственно (р < 0,05). У больных ОА концентрация TNFá имела прямую связь с показателем хемокина CXCL17 (r = 0,83, p < 0,05), что свидетельствует о взаимосвязях молекул, опосредованных этим медиатором и продукцией цитокинов тканевыми макрофагами при воспалении.

 

Рисунок 1. Содержание интерлейкинов IL-1β (А), IL-6 (Б), хемокина CXCL17 (В) и фактора некроза опухоли TNFα (Г) в сыворотке крови

Figure 1. Сontent of interleukins IL-1β (A), IL-6 (B), chemokine CXCL17 (C) and tumor necrosis factor TNFa (D) in blood serum

 

Концентрации белков теплового шока HSP27, HSP70 и их соотношение были достоверно ниже у больных ОА по сравнению с контрольной группой (соответственно: z = -3,06, p = 0,002; z = -4,41, p = 0,00001; z = -2,05, p = 0,04), что позволяет судить о толерантности рентгенологических проявлений ОА содержание HSP27 достоверно не изменялось (p > 0,05), но отмечалось показателя соотношения уровней HSP27/HSP70 перемещение в его сторону (табл. 1, p < 0,05). Корреляционный анализ показал, что у больных с I стадией концентрация HSP27 и HSP70 была прямо связана с показателями содержания TNFá (R = 0,45, p < 0,05 и R = 0,34, p < 0,05 соответственно) и хемокина CXCL17 (R = 0,34, p < 0,05 и R = 0,58, p < 0,05). Также в прямой корреляции находились значения концентрации TNFá и CXCL17 (R = 0,68, p < 0,05). При II стадии ОА уровень HSP70 был достоверно связан с концентрацией TNFá (R = -0,32, p < 0,05), а содержание последнего коррелировало с CXCL17 (R = 0,78, p < 0,05). При III стадии достоверная прямая связь обнаруживалась между уровнями белков теплового шока и TNFá и CXCL17 (R = 0,71, p < 0,05; R = 0,36, p < 0,05 соответственно), последние также имели прямую связь между собой (R = 0,49, p < 0,05).

 

Таблица 1. Содержание белков теплового шока HSP27 и HSP70 в сыворотке крови, Me (Q_0,25-Q_0,75)

Table 1. CONTENT OF HEAT SHOCK PROTEINS HSP27 AND HSP70 IN BLOOD SERUM, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Показатель Indicator	Здоровые лица Volunteers (n = 30)	Стадия остеоартрита Stage of osteoarthritis
		I (n = 12)	II (n = 30)	III (n = 10)
HSP70, пг/мл HSP70, pg/mL	3,9 (3,2-4,8)	3,7 (1,5-4,9)	2,2 (1,2-2,7)* Z = 2,08; p = 0,04	1,8 (0,8-3,8)*
HSP27, пг/мл HSP27, pg/mL	1,6 (0,7-4,1)	0,3 (0,3-0,7)	0,4 (0,3-0,5)	0,3 (0,2-0,4)
HSP70/HSP27	2,7 (1,43-5,40)	5,3 (4,7-14,9)	4,9 (3,3-6,2)	4,3 (1,9-9,2)*

Примечание. * – статистически значимые различия с І стадией по критерию Манна–Уитни, р < 0,05.

Note. *, statistically significant differences with stage I according to the Mann–Whitney test, p < 0.05.

 

Цитокины и хемокины являются важными факторами, участвующими в регуляции гомеостаза и развития тканей, а также патогенеза различных процессов, таких как воспаление, фиброз и новообразования. Показано, что данные о содержании провоспалительных цитокинов и хемокинов в сыворотке крови могут служить прогностическими индикаторами и факторами скрининга в патогенезе заболеваний костной системы [15]. Из провоспалительных цитокинов, участвующих в развитии ОА, IL-1â и TNFá играют основную роль, так как первый связан с разрушением хряща, а второй с запуском воспалительного каскада [2, 10]. Эти медиаторы продуцируются хондроцитами, мононуклеарными клетками, остеобластами и синовиальными тканями, в дальнейшем, индуцируют выработку ряда воспалительных и катаболических факторов и могут действовать независимо или совместно с другими цитокинами.

В настоящем исследовании, в качестве медиаторов, принимающих участие в развитии воспаления, проанализировано содержание в сыворотке крови больных остеоартритом (ОА) наиболее важных индикаторов, а именно IL-1β, IL-6, хемокина CXCL17, фактора некроза TNFá и белков теплового шока HSP27, HSP70. Показано, что уровни интерлейкинов IL-1β и IL-6 и TNFá у больных ОА существенно превышали показатели для здоровых лиц. Эти данные согласуются с исследованием Goekoop и соавт., где изучалась связь между содержанием цитокинов и наличием ОА [5]. Было установлено, что у лиц пожилого возраста при низкой врожденной продукции IL- 1RA и IL-6 отсутствует это заболевание. В отношении IL-6 показано, что его высокий уровень в сыворотке связан с продукцией мононуклеарными клетками периферической крови и определяется при повышенном риске потери хряща в коленном суставе [9]. Причем в процессе развития ОА продукция различных воспалительных цитокинов может варьировать в зависимости от длительности и тяжести заболевания [13, 14]. В свою очередь, медиатор CXCL17 известен как корегулируемый фактором роста эндотелия сосудов хемокин (VCC-1) и хемокиноподобный белок, привлекающий дендритные клетки и моноциты (DMC). Его опосредованное воздействие через рецептор запускает внутриклеточную сигнализацию через различные пути, в том числе циклический аденозинмонофосфат, ERK1/2 и др., инициируя тем самым воспаление [3]. Нами продемонстрировано повышение уровня CXСL17 у больных ОА и его корреляция с показателями содержания интерлейкинов и TNFá. Выявленные нами тенденции вполне закономерны, если принять во внимание известные данные, что продукция CXСL17 клетками активируется при воздействии IL-1β и TNFá [4].

Согласно полученным нами данным, по сравнению с показателями здоровых лиц у больных ОА наблюдаются значимо низкие уровни белков теплового шока HSP27 и HSP70. При этом концентрация HSP70 имеет тенденцию к снижению по мере прогрессирования заболевания, тогда как уровень HSP27 значимо не меняется, оставаясь достоверно ниже контроля. Эти данные указывают на отсутствие синергичной активации этих белков в ответ на воспаление, что согласуется с данными других исследователей, которые показали, что уровень циркулирующего и синовиального HSP70 положительно коррелирует с показателями рентгена, на основании которых оценивалась степень тяжести ОА коленного сустава [11, 14]. Роль малых белков теплового шока, к которым относится HSP27, изучена недостаточно, однако известно, что снижение его уровня в суставных тканях при ОА сопровождается снижением их толерантности к провоспалительным цитокинам, главным образом, TNFá и IL-6 [13]. Согласно нашим данным, значительное снижение соотношения HSP70/HSP27 в сторону антиапоптотических значений дает возможность высказать предположение, что при ОА указанные белки демонстрируют двойной эффект: с одной стороны, способность снижать иммунологическую активности за счет уменьшения содержания HSP70, а с другой – уменьшать их проапоптотическое действие.

Заключение

Определение уровня системных межклеточных медиаторов позволяет использовать эти показатели в качестве потенциальных биохимических маркеров для прогнозирования тяжести заболевания и оценки их фундаментальной роли в патогенезе ОА коленного сустава.

About the authors

N. G. Plekhova

Pacific State Medical University

Author for correspondence.
Email: pl_nat@hotmail.com

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Interdisciplinary Research Center

Russian Federation, Vladivostok

M. A. Kabalyk

Pacific State Medical University

Email: pl_nat@hotmail.com

PhD (Medicine), Associate Professor, Leading Research Associate, Interdisciplinary Research Center

Russian Federation, Vladivostok

E. V. Prosekova

Pacific State Medical University

Email: pl_nat@hotmail.com

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Clinical Laboratory Diagnostics, General and Clinical Immunology

Russian Federation, Vladivostok

V. B. Shumatov

Pacific State Medical University

Email: pl_nat@hotmail.com

PhD, MD (Medicine), Professor, Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Head, Department of Anesthesiology, Resuscitation, Intensive Care and Emergency Medical Care

Russian Federation, Vladivostok

References

Supplementary files