Dynamics of VEGF and TGF-β indices in lacrimal fluid as a predictor of corneal transplant rejection

Full Text

Введение

С момента проведения первой трансплантации роговицы человеку Эдуардом Зирмом в 1905 году сквозная кератопластика является наиболее распространенной формой пересадки твердых тканей. В 2023 году в США было выполнено около 70 000 трансплантаций роговицы с использованием консервированной ткани (Eye Bank Association of America / U.S. Government Information on Organ Donation and Transplantation).

Несмотря на то, что роговица считается иммунопривилегированной тканью, трансплантация всегда сопряжена с риском отторжения из-за несоответствия антигенного репертуара донора и реципиента. Однако пересадка роговицы, в отличие от трансплантации других органов, более успешна, что обусловлено в первую очередь ее иммунными преимуществами [5].

Выделяют следующие основные механизмы, ответственные за иммунную привилегию роговицы: механизм лимфангиогенной и гемангиогенной привилегии, феномен иммунного отклонения (ACAID) и внутриглазное иммуносупрессивное микроокружение [7]. Механизм лимфангиогенной и гемангиогенной привилегии основан на отсутствии кровеносных и лимфатических сосудов в роговице, что с одной стороны делает роговицу оптически прозрачной, а с другой – защищенной от собственной иммунной системы. В норме кровеносные сосуды образуют петлистую сеть, окружающую роговицу и расположенную на 1–5 мм за пределами лимба, в то время как лимб имеет естественные барьеры, к которым относятся мембрана Боумена и стромальные коллагены I и V типов, не позволяющие лимбальным сосудам прорастать в прилежащую роговицу. Последние являются ингибиторами стромальных проангиогенных факторов, регулирующих сосудистую инвазию стромы роговицы. Немаловажную роль в барьерной функции играют и перициты [7, 14]. Кроме того, гуморальные факторы, присутствующие в роговице и водянистой влаге, включают целый каскад ангиостатических инструментов. В частности, эпителий роговицы секретирует тромбоспондин-1 (TSP-1), растворимый FLT-1 (sFLT-1), рецептор VEGF3 (VEGFR-3), фактор пигментного эпителия (PEDF), эндостатин и лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с семейством TNF. Водянистая влага содержит несколько факторов, включая трансформирующий фактор-â2 (TGF-â2), á-меланоцитстимулирующий гормон (á-MSH) и вазоинтестинальный пептид (VIP) [7, 10]. Лимб роговицы содержит меланоциты, экспрессирующие тирозиназу – медьсодержащую монофенольную монооксигеназу, ингибирующую ферментативные реакции, дефицит которой индуцирует лимфатический рост в лимбе роговицы [5, 14]. TSP-1 является негативным регулятором ангиогенеза роговицы и действует путем связывания с TGF-â и взаимодействия с эндотелиальными клетками сосудов, вызывая апоптоз [3]. sFLT-1 обычно обнаруживается в роговице, и любой его дефицит может привести к VEGF-A-зависимому росту сосудов лимба [1]. VEGFR-3 действует как рецептор-ловушка для ангиогенного фактора роста VEGF-C [4]. PEDF ингибирует ангиогенез роговицы, индуцированный основным фактором роста фибробластов. TRAIL ингибирует как лимфангиогенез, так и ангиогенез [2, 5, 7].

Вышеописанный комплекс анатомических, клеточных и гуморальных механизмов позволяет выделить кератопластику группы «низкого риска» отторжения, так как пересадка аллотрансплантата роговицы в данном случае происходит в бессосудистое ложе реципиента и послеоперационный прогноз достаточно благоприятный. Выживаемость трансплантата в таких условиях составляет около 90% через 1 год и 55% через 15 лет [12]. Феномен иммунного отклонения, связанный с передней камерой глаза, является одним из ключевых иммуносупрессивных Fas-опосредованных механизмов [8]. Защиту трансплантата в регионарных лимфатических узлах глаза обеспечивают IL-10, трансформирующий фактор роста (TGF-â), и Т-регуляторные (Treg) клетки, экспрессирующие FoxP3 [6].

Целью исследования явилось определение концентрации фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и трансформирующего фактора роста-â (TGF-â) в слезной жидкости в динамике послеоперационного периода сквозной кератоплатики у пациентов групп «высокого риска» и «низкого риска».

Материалы и методы

Проведено проспективное нерандомизированное исследование биоматериала собранного у 42 пациентов с патологией роговицы, которым на базе отделения офтальмологии ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница» проводилось выполнение сквозной кератопластики. Среди пациентов было 28 женщин (61,54%) и 14 мужчин (38,46%) в возрасте от 31 до 65 лет, средний возраст составил 53,1±4,4 года. Отбор пациентов для исследования осуществляли методом сплошной выборки согласно критериям включения: любая патология роговицы, требующая проведения сквозной кератопластики. Хирургический компонент лечения заключался в проведении сквозной аллотрансплантации донорской консервированной в среде Борзенка–Мороз роговицы. Начиная с 1-го дня послеоперационного периода всем пациентам проводилась стандартная антибактериальная и локальная противовоспалительная терапия стероидными гормонами. Пациенты основной группы до начала оперативного лечения были разделены на 2 подгруппы: 2а, включающую пациентов «низкого риска», т. е. имеющих аваскулярное ложе в исходе эктазии роговицы, буллезной кератопатии, являющейся вторичной эндотелиально-эпителиальной дистрофией, возникшей после проведения хирургических операций на переднем отделе глаза, или генетически детерминированной дистрофией Фукса – всего 16 пациентов (16 глаз); вторую подгруппу 2б составили пациенты «высокого риска», имеющие признаки васкуляризации ложа в исходе кератитов вирусной этиологии (рис. 1A, см. 2-ю стр. обложки), посттравматических рубцовых помутнений роговицы, язв роговицы, а также случаи рекератопластики – 15 пациентов (15 глаз).

Контрольная (3) группа включала 10 человек (10 глаз), в ходе осмотра у которых не было выявлено глазных заболеваний. Иммунологическое исследование в слезной жидкости пациентов концентрации фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и трансформирующего фактора роста-â (TGF-â) проводилось до начала хирургического лечения и в динамике послеоперационного периода через 1 и 6 месяцев. Иммунологическое исследование выполнено методом мультиплексного анализа на иммуноанализаторе Luminex Magpix 100 (США) с использованием тест-системы Bio-Rad (США). От пациентов были получено письменное информированное согласие о цели забора биологического материала.

Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением методов непараметрической статистики, выполнена с помощью Windows XP и пакета прикладных программ Statistica v.10.0 for Windows. Статистически значимыми считались различия при p ≤ 0,05. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха – Me (Q_0,25-Q_0,75).

Результаты и обсуждение

Референсные значения изучаемых факторов роста VEGF и TGF-â, детектируемые в слезной жидкости здоровых глаз, составили, соответственно, 86,7 (68,3-92,5 пг/мл) и 42,3 (38,4-54,1 пг/мл), продемонстрировав наличие иммуносупрессивной интраокулярной среды, способствующей подавлению активации иммунных клеток мукозо-ассоциированной ткани региона глаза.

Исследования содержания изучаемых факторов в динамике послеоперационного периода после сквозной кератопластики представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Содержание VEGF и TGF-β в слезной жидкости в динамике после кератопластики, Me (Q_0,25-Q_0,75)

Table 1. content of VEGF and TGF-β in lacrimal fluid in dynamics after keratoplasty, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Биологически активные вещества, пг/мл Biologically active substances, pg/mL	Подгруппа 2а «низкий риск», n = 16 глаз Subgroup 2a "low risk", n = 16 eyes	Подгруппа 2б «высокий риск», n = 15 глаз Subgroup 2b "high risk", n = 15 eyes
До кератопластики Before keratoplasty
VEGF	85,1 (79,2-91,4)	95,2 (88,6-102,3)
TGF-β	41,3 (38,8-46,7)	21,2 (19,4-26,1)*,**
Через 1 месяц после кератопластики 1 month after keratoplasty
VEGF	84,3 (75,3-89,7)	198,7 (171,5-209,1) *,**
TGF-β	45,4 (40,4-52,3)	19,2 (17,5-25,4)*, **
Через 6 месяцев после кератопластики 6 months after keratoplasty
VEGF	84,5 (72,3-91,7)	111,2 (109,7-125,6)*, **
TGF-β	49,2 (37,4-56,4)	13,3 (10,5-18,1)*, **

Примечание. * – значимые (р ≤ 0,05) различия с подгруппой 2а; ** – с показателями здоровых глаз согласно непараметрическому критерию Манна–Уитни.

Note. *, significant (p ≤ 0.05) differences with subgroup 2a; **, with indicators of healthy eyes according to the nonparametric Mann–Whitney test.

 

Концентрация вазоформного цитокина VEGF и иммуносупрессивного трансформирующего фактора роста-â в слезной жидкости пациентов «низкого риска» до оперативного лечения и в динамике через 1 и 6 месяцев наблюдения не имела значимых различий с показателями группы здоровых доноров, что является отражением сохранности механизмов, препятствующих иммуносенсибилизации роговицы после кератопластики и является предиктором благоприятного исхода оперативного лечения (рис. 1Г, см. 2-ю стр. обложки).

 

Иллюстрации к статье «ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ VEFG И TGF-â В СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ КАК ПРЕДИКТОР РЕАКЦИИ ОТТОРЖЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА РОГОВИЦЫ» (АВТОРЫ: Быстров А.М., Кузнецов А.А. [с. 103-108])

ILLUSTRATIONS FOR THE ARTICLE "Dynamics of VEGF and TGF-â indices in lacrimal fluid as a predictor of corneal transplant rejection" (AuthorS: Bystrov A.M., Kuznetzov A.A. [pp. 103-108])

Рисунок 1. Фото переднего отрезка до и после пересадки роговицы

Примечание. A – пациент группы «высокого риска» до хирургического лечения: васкуляризированное рубцовое помутнение роговицы в исходе герпетического кератита; Б – пациент группы «высокого риска» через 6 месяцев после хирургического лечения: хроническая эндотелиально-стромальная реакция отторжения, активная неоваскуляризация; В – пациент группы «низкого риска» до хирургического лечения: кератоконус III-IV стадии, клиническое отсутствие считается признаком воспаления глаза и васкуляризации роговицы; Г – пациент группы «низкого риска» через 6 месяцев после хирургического лечения: прозрачный трансплантат без признаков реакции отторжения.

Figure 1. Photo of the anterior segment before and after corneal transplantation

Note. А, patient of group “high risk” before surgical treatment: vascularized scarring of the cornea in the outcome of herpetic keratitis; B, patient of group “high risk” 6 months after surgical treatment: chronic endothelial stromal rejection reaction, active neovascularization; C, patient of group “low risk” before surgical treatment: keratoconus of stage III-IV, clinical absence is a sign of inflammation of the eye and corneal vascularization; D, patient of group “low risk” 6 months after surgical treatment: transparent graft with no signs of rejection reaction.

 

В группе пациентов «высокого риска» нами отмечено значимое снижение в слезной жидкости TGF-â до начала хирургического этапа лечения, что свидетельствует о снижении иммуносупрессивного фона внутренних сред глаза. В динамике после кератопластики концентрация TGF-â прогрессивно снижалась, достигнув минимального значения через 6 месяцев после оперативного лечения. Известно, что TGF-â способен подавлять иммунные реакции [9], оказывать негативную регуляцию в отношении дифференцировки и активации Т, В-лимфоцитов и NK-клеток [7, 15]. Установлено его участие в процессах подавления реакции отторжения трансплантата, индукции апоптоза новообразованных эндотелиоцитов и ингибировании лимфангиогенеза, имеющих значение в поддержании аваскулярности роговицы, а его снижение свидетельствует о высоком риске отторжения донорской роговицы.

Концентрация VEGF в подгруппе 2б пациентов с высоким риском отторжения трансплантата на этапе до оперативного лечения не выходила за пределы референсных значений, однако через 1 месяц нами зафиксирован значимый рост показателя, почти двукратно превышающий исходные значения и некоторую тенденцию к снижению через 6 месяцев наблюдения. Исходом оперативного лечения пациентов «высокого риска» часто является реакция отторжения и активная неоваскуляризация трансплантата (рис. 1Б, В; см. 2-ю стр. обложки).

VEGF-зависимая неоваскуляризация ткани дополнительно усиливает кинетику и выраженность иммунного ответа против собственных антигенов глаза, обеспечивая транспортировку аллоантигенов с поверхности глаза к периферическим лимфоидным органам и последующую вторичную миграцию сенсибилизированных эффекторных иммунных клеток обратно в аллотрансплантат [11, 13].

Заключение

Установленный нами в группе пациентов «высокого риска» дисбаланс факторов, обеспечивающих в норме поддержание иммуносупрессивной интраокулярной среды, увеличивает риски отторжения трансплантата донорской роговицы, возрастающие по мере снижения концентрации иммуносупрессивных факторов, таких как трансформирующий фактор роста-â и повышения концентрации вазоформных цитокнов, в частности VEGF, способствующих иммунной сенсибилизации и неолимфаниогенезу тканей роговицы.

About the authors

A. M. Bystrov

Chelyabinsk Regional Clinical Hospital

Author for correspondence.
Email: highvision@bk.ru

Clinical Ophtalmologist, Ophthalmology Department No. 1

Russian Federation, Chelyabinsk

A. A. Kuznetzov

Chelyabinsk Regional Clinical Hospital

Email: highvision@bk.ru

PhD (Medicine), Head, Ophthalmology Center

Russian Federation, Chelyabinsk

References

Supplementary files