Missense mutation 1234C>T of TOLL-like receptor 3 gene in ulcerative colitis

Full Text

Введение

Гомеостаз кишечника поддерживается за счет динамического взаимодействия иммунной системы хозяина и местной микробиоты, которая состоит из бактерий, архей, грибов и вирусов. Соответственно, нарушение равновесия обусловлено не только изменением состава микробиоты, но и гипер- или гипоактивацией иммунного ответа, мутациями в генах иммунной системы. Принято считать, что воспалительным заболеваниям кишечника (ВЗК) характерна сложная этиопатология, в которой участвуют иммунная система, генетическая предрасположенность и микробиота [2].

Первой линией взаимодействия с микробиотой и патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (PAMPs) являются Toll-подобные рецепторы (TLR) – трансмембранные белки, расположенные на внешней мембране клеток и на эндосомах.

В желудочно-кишечном тракте TLRs распознают микроорганизмы, проникающие через кишечный барьер, однако сильный сигнал активации может привести к хроническим воспалительным процессам. Поэтому иммунный ответ, опосредованный данными рецепторами, а также их влияние на восприимчивость к заболеванию является важным объектом исследования при ВЗК [7].

В результате метагеномных исследований было обнаружено, что в здоровом кишечнике обитает множество резидентных вирусов. Резидентные кишечные вирусы могут оказывать не только иммуномодулирующее действие, но и вызывать хронические вирусные инфекции, например герпесвирусы и эндогенные ретровирусы, что также связывают с возникновением и обострением ВЗК [9].

Вирусные PAMPs, а именно двух- и одноцепочечные РНК, распознаются, соответственно, TLR3 и TLR7, расположенными на мембранах эндосом. Сигнальный комплекс «TLR3 – двухцепочечная РНК (дцРНК)» образован двумя молекулами TLR3 и одной молекулой дцРНК [5].

В исследовании Yang J.Y. и соавт. на мышиных моделях было показано, что у мышей, получавших противовирусный коктейль, развивается более тяжелая форма экспериментального колита, вызванного декстрансульфатом натрия (DSS), по сравнению с мышами, не получавшими коктейль. Когда мышам вводили агонисты TLR3 или TLR7, либо инактивированный ротавирус, симптомы колита значительно улучшались. Мыши с дефицитом как TLR3, так и TLR7 были более восприимчивы к экспериментальному колиту. Также авторы обнаружили, что у людей сочетание генетических вариаций TLR3 и TLR7 значительно влияло на тяжесть НЯК. Комбинированные мутации двух генов значительно повлияли на исход заболевания у пациентов с НЯК [9].

Ранее сообщалось, что уровень экспрессии TLR3 значительно снижен в эпителиоцитах пациентов с активным ВЗК [1]. В другом исследовании экспрессии TLRs в период ремиссии НЯК обнаружено снижение экспрессии TLR1, TLR3, TLR6. А в образцах нормальной слизистой оболочки и активного НЯК экспрессия данных TLR была выше, чем при ремиссии. Авторы предполагают, что НЯК может быть связан со специфическими изменениями в селективной экспрессии TLRs в эпителии кишечника [3].

На активность рецептора влияет не только уровень его экспрессии, но и наличие однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в гене, приводящие к различным изменениям в структуре белка, например в участке связывания с лигандом. Одним из таких вариантов является миссенс-мутация 1234C>T в 4 экзоне гена TLR3, которая вызывает изменение кодона аминокислот с лейцина на фенилаланин в положении 412 [5]. Этот SNP не влияет на уровень транскрипции TLR3, но снижает способность рецептора присоединяться к дцРНК, что приводит к гипоактивности TLR3 в организме человека. В данном случае структура белка становится нестабильной, так как эктодомен рецептора TLR3, сформированный вариацией Leu412Phe, находится близко к месту гликозилирования (Asn413) и является важной областью димеризации домена на мембране эндосомы [5].

Цель настоящего исследования – выявить ассоциацию аллелей, генотипов гена эндосомального рецептора TLR3 и его гаплотипов с Toll-подобными рецепторами субсемейства TLR2 (TLR1, TLR2, TLR6) с неспецифическим язвенным колитом в популяции русских Челябинской области.

Материалы и методы

Для исследования было отобрано 96 лиц с диагностированным неспецифическим язвенным колитом и 86 условно здоровых лиц из числа потенциальных доноров стволовой клетки ГБУЗ «ЧОСПК». Принадлежность обследуемых лиц к русской этнической группе была подтверждена данными генеалогического анамнеза в трех поколениях.

Материал был получен из цельной крови путем выделения образцов ДНК колоночным методом (Protrans DNA Box 500, ФРГ). Полиморфные участки генов амплифицировались методом аллель специфической ПЦР и ПДРФ (ООО НПФ «Литех», Россия), продукты амплификации детектировались электрофорезом в 3%-ном агарозном геле с УФ-визуализацией. Был протипирован однонуклеотидный полиморфизм (SNP) 1234C>T (Leu412Phe) в гене TLR3. Для оценки параметров неравновесного сцепления использовались ранее полученные данные для следующих SNP: 1805T>G (Ser602Ile) в гене TLR1, 2258G>A (Arg753Gln) в гене TLR2, 745C>T (Ser249Pro) в гене TLR6. Частоты встречаемости аллелей, генотипов и гаплотипов сравнивались с использованием критерия Пирсона (÷²), критерия ÷² с поправкой Йетса, точного критерия Фишера. Показатели сцепления гаплотипов рассчитывались в программе Arlequin ver. 3.5. По значениям показателя отношения шансов (OR) оценивали силу ассоциаций аллелей, генотипов и гаплотипов с риском развития НЯК. Данные считали статистически значимыми при p ≤ 0,05, промежуточные значения 0,05 < p ≤ 0,1 считали тенденцией к различиям, при р > 0,10 – незначимыми.

Результаты и обсуждение

В рамках настоящего исследования были оценены частоты встречаемости аллелей и генотипов SNP 1234C>T в гене TLR3. Полученные результаты представлены в таблице 1. Из таблицы видно, что в группе больных НЯК частота мутантного аллеля T в процентном соотношении выше примерно на 10, чем в контрольной группе (36,5% против 25,0%). Различия имеют статистическую значимость (p = 0,019; OR = 1,72; 95% ДИ: 1,09-2,71).

 

ТАБЛИЦА 1. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЧАСТОТ ВСТРЕЧАЕМОСТИ АЛЛЕЛЕЙ И ГЕНОТИПОВ SNPs ГЕНА TLR3 В ИССЛЕДУЕМЫХ ГРУППАХ

TABLE 1. DISTRIBUTION OF ALLELE AND GENOTYPE FREQUENCIES OF SNPs OF TLR3 GENE IN THE STUDIED GROUPS

Аллели / генотипы Alleles / genotypes	Группа больных НЯК Group of patients with UC	Группа сравнения Control	Сравнение ÷2, p, OR, 95% ДИ Comparison ÷2, p, OR, 95% CI
	n = 96 Абс. частота (%) Absolute frequency (%)	n = 86 Абс. частота (%) Absolute frequency (%)
SNP 1234C>T TLR3
C	122 (63,5)	129 (75,0)	÷2 = 5,56 p = 0,019 OR = 1,72 (1,09-2,71)
T	70 (36,5)	43 (25,0)
C/C	40 (41,7)	46 (53,5)	÷2 = 2,54 p = 0,11
C/T	42 (43,7)	37 (43,0)	÷2 = 0,01 p = 0,92
T/T	14 (14,6)	3 (3,5)	÷2 = 6,59 p = 0,011 OR = 4,72 (1,31-17,05)

 

В частотах встречаемости генотипов в группе больных НЯК наблюдается повышенная частота гомозиготного генотипа T/T, образованного мутантным аллелем. Величина параметра отношения шансов (OR), полученная при сравнении частот генотипов T/T против C/C + C/T, указывает на то, что генотип T/T может являться фактором риска развития неспецифического язвенного колита (p = 0,011; OR = 4,72; 95% ДИ: 1,31-17,05).

Следующим этапом исследования была оценка параметров неравновесного сцепления и частот двухлокусных гаплотипов, образованных такими SNPs, как 1234C>T TLR3, 2258G>A TLR2, 745C>T TLR6, 1805T>G TLR1. Выбор рецепторов и их полиморфизмов для оценки обусловлен расположением генов указанных TLRs на одной (четвертой) хромосоме. Частоты встречаемости двухлокусных гаплотипов представлены в таблице 2.

 

ТАБЛИЦА 2. ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ДВУХЛОКУСНЫХ ГАПЛОТИПОВ В ИССЛЕДУЕМЫХ ГРУППАХ

TABLE 2. FREQUENCIES OF OCCURRENCE OF BILOCUS HAPLOTYPES IN THE STUDIED GROUPS

Гаплотипы Haplotypes	Частота гаплотипа ± ошибка среднего Haplotype frequency ± standard error		Сравнение ÷2, p, OR, 95% ДИ Comparison ÷2, p, OR, 95% CI
	Группа больных НЯК Group of patients with UC n = 96	Группа сравнения Control n = 86
TLR3 ~ TLR2
1234*C ~ 2258*G	0,590±0,036	0,690±0,035	÷2 = 3,79 р = 0,052 OR = 0,651 (0,420-1,004)
1234*T ~ 2258*A	0,070±0,018	0,006±0,006	÷2 = 7,80 р = 0,006 OR = 12,42 (1,61-95,97)
TLR3 ~ TLR6
1234*C ~ 745*C	0,380±0,037	0,370±0,035	÷2 = 0,07 p = 0,79
1234*T ~ 745*T	0,200±0,031	0,260±0,032	÷2 = 1,64 p = 0,20
TLR3 ~ TLR1
1234*T ~ 1805*T	0,150±0,026	0,060±0,019	÷2 = 6,96 р = 0,009 OR = 2,94 (1,35-6,42)
1234*C ~ 1805*G	0,570±0,036	0,47±0,04	÷2 = 1,34 р = 0,25

 

Необходимо отметить, что аллели сцеплены в исследуемых группах по разному и не образуют устойчивые гаплотипы. За основу были взяты гаплотипические сочетания, обнаруженные в группе больных НЯК и сравнены с группой контроля. Рассмотрим более подробно каждое из них.

Для пары TLR3(1234C>T)-TLR2(2258G>A) обнаружено два гаплотипа: неравновесное сцепление предковых аллелей 1234*C ~ 2258*G и мутантных аллелей 1234*T ~ 2258*A. Данные гаплотипические сочетания в группе больных НЯК устойчивые (D’ = 0,4; ÷² = 6,6; p = 0,01). При сравнении частот встречаемости указанных гаплотипов в группах больных НЯК и контроля обнаружены статистически значимые различия, однако частоты гаплотипа 1234*C ~ 2258*G, образованного предковыми аллелями, не несут прогностического значения (р = 0,052; OR = 0,651; 95% ДИ: 0,42-1,004). Напротив, гаплотип 1234*T ~ 2258*A, образованный сцеплением мутантных аллелей, может быть ассоциирован с риском развития НЯК, о чем свидетельствует анализ отношения шансов (р = 0,006; OR = 12,42; 95% ДИ: 1,61- 95,97).

Гаплотипы, обнаруженные в паре TLR3(1234C>T)-TLR1(1805T>G), образованы неравновесным сцеплением мутантного аллеля с предковым 1234*T ~ 1805*T, и наоборот 1234*C ~ 1805*G. Устойчивость гаплотипических сочетаний в группе больных НЯК была высокая (D’ = 0,38; ÷² = 16,1; p = 0,0001). Анализ частот распределения гаплотипов в группах показал, что частоты гаплотипов 1234*T ~ 1805*T и 1234*C ~ 1805*G были выше в группе больных НЯК, чем группе сравнения (15% против 6%, 57% против 47% соответственно). Однако для гаплотипа 1234*C ~ 1805*G по данному параметру статистически значимых различий в исследуемых группах не обнаружено (÷² = 1,34; р = 0,25). Для гаплотипа 1234*T ~ 1805*T были показаны статистически значимые различия в распределении частот в двух группах. Данный гаплотип может быть фактором предрасположенности к неспецифическому язвенному колиту (р = 0,009; OR = 2,94; 95% ДИ: 1,35-6,42).

Обнаруженные гаплотипы для пары TLR3(1234C>T)-TLR6(745C>T) были образованы сцеплением двух предковых 1234*C ~ 745*C и двух мутантных аллелей 1234*T ~ 745*T. Данные гаплотипические сочетания были одинаковые для исследуемых групп и в обеих группах демонстрировали устойчивость (D’ = 0,56; ÷² = 13,3; p = 0,0003 для группы больных НЯК; D’ = 0,39; ÷² = 14,8; p = 0,0001 для контрольной группы). Но частоты данных двухлокусных гаплотипов в исследуемых группах мало отличались в процентном соотношении и не имели статистически значимых различий (÷² = 0,07; p = 0,79 для гаплотипа 1234*C ~ 745*C; ÷² = 1,64; p = 0,20 для гаплотипа 1234*T ~ 745*T). Таким образом, двухлокусные гаплотипы, образованные SNPs 1234C>T(TLR3) и 745C>T(TLR6), не могут быть факторами предрасположенности к НЯК в наших исследуемых группах.

Заключение

Представленные результаты являются предварительными данными исследования, посвященного ассоциации генетических комбинаций генов системы TLRs с неспецифическим язвенным колитом. Обычно объектами таких исследований являются TLRs, расположенные на наружных мембранах клеток и распознающие микробные PAMPs – липопротеин, пептидогликаны, липополисахариды (TLR1, TLR2, TLR4, TLR6) [4, 6]. Для некоторых SNPs в их генах обнаружена связь с риском развития НЯК [7, 8].

Исследований, изучающих ассоциацию однонуклеотидных полиморфизмов в генах TLR3, TLR7, TLR8 с ВЗК немного, что связано с эндосомальным расположением и лигандами этих рецепторов (дцРНК и оцРНК вирусов). Однако в кишечнике обнаружено большое количество резидентных вирусов, которые обладают иммуномодулирующим действием и могут участвовать в развитии патологического процесса при ВЗК [9].

Именно поэтому в своей работе мы оценивали частоты распределения аллелей и генотипов SNP 1234C>T в гене TLR3, а также частоты гаплотипов, образованных с TLRs субсемейства TLR2 (TLR1, TLR2, TLR6), гены которых расположены на одной с TLR3 хромосоме. В нашей работе наличие мутантного аллеля T и гомозиготного генотипа TT в гене TLR3 были ассоциированы с предрасположенностью к неспецифическому язвенному колиту. Также гаплотипы 1234*T ~ 2258*A (TLR3 ~ TLR2) и 1234*T ~ 1805*T (TLR3 ~ TLR1) были связаны с риском развития данного заболевания в популяции русских Челябинской области.

About the authors

E. A. Abubakirova

Chelyabinsk State University

Author for correspondence.
Email: alveera@mail.ru

Postgraduate Student, Department of Microbiology, Immunology and General Biology, Biological Faculty

Russian Federation, Chelyabinsk

D. S. Stashkevich

Chelyabinsk State University

Email: alveera@mail.ru

PhD (Biology), Associate Professor, Dean, Biological Faculty

Russian Federation, Chelyabinsk

A. V. Evdokimov

Chelyabinsk State University

Email: alveera@mail.ru

PhD (Biology), Associate Professor, Department of Microbiology, Immunology and General Biology, Biological Faculty

Russian Federation, Chelyabinsk

References

Supplementary files