Experimental type 2 diabetes increases the number of insulin-positive cells in rat spleen

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Type 2 diabetes (T2D) is a chronic metabolic disease, being one of the leading causes of death and disability worldwide. Immune system disorders play an important role in the T2D pathogenesis, and immune system is exposed to increased stress resulting both of changes in immunometabolic regulation and disruption of tissue homeostasis caused by oxidative stress and chronic inflammation. Opportunities for adaptation of immune organs in T2D are of interest, especially, potential ectopic expression of insulin. Under hyperglycemic conditions, insulin-containing cells were detected in various organs, including the spleen. The aim of the present work was to estimate the number of insulin-positive cells (IPCs) in the spleen of rats with experimental T2D. The disorder was induced in mature male Wistar rats by intraperitoneal administration of 110 mg/kg nicotinamide followed by 65 mg/kg streptozotocin. 30 days later, blood samples and spleens were obtained. The level of glycemia, insulin contents, activity of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) in blood were assessed as well as markers of oxidative stress in the spleen. Biochemical studies revealed an increase in ALT activity in blood, along with increase in malondialdehyde (MDA) levels and decreased levels of reduced glutathione (GSH) in the spleen tissue of rats with experimental T2D. Meanwhile the activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase in the spleen did not change. An increase in MDA level associated with unchanged activity of antioxidant enzymes and decreased GSH content suggests the development of oxidative stress in the tissue. Microscopy of spleen tissues was examined by immunohistochemistry using antibodies to proinsulin and insulin, showing an increased number of insulin-positive cells (IPCs) in the spleen tissue of rats with experimental T2D compared with diabetes-free animals. Optical density of the IPC cytoplasm was found to be increased in diabetic rats, thus suggesting increased functional activity of IPCs. Increase of numbers and functional activities of IPCs in the spleen in experimental model of T2D may indicate an adaptive role of extra-pancreatic insulin expression under the conditions of oxidative stress and cytolysis, including those in immunopoietic organs.

Full Text

Введение

Сахарный диабет (СД) является одной из основных причин смертности и инвалидизации во всем мире, при этом количество больных неуклонно растет, составляя на настоящий момент около 500 млн человек, большая часть которых страдает диабетом второго типа (СД2) [7]. Метаболические нарушения, лежащие в основе патогенеза СД2, развиваются в тесной взаимосвязи с нарушениями иммунной системы [5, 13] и окислительным стрессом [13]. Дисбаланс между выработкой активных форм кислорода (АФК) и активностью системы антиоксидантной защиты влияет на сигнальные пути и в конечном счете нарушает гомеостаз в тканях и их функцию [13]. Окислительное повреждение селезенки усиливает деструктивные процессы в ней, что в свою очередь приводит к снижению скорости образования иммунокомпетентных клеток и нарастанию дисфункции иммунной системы. В связи с этим особый интерес представляют механизмы тканевой адаптации, одним из которых предположительно может являться образование инсулин-продуцирующих клеток. Исследования внепанкреатической экспрессии инсулина за несколько десятилетий прошли путь от констатации факта присутствия инсулин-позитивных клеток (ИПК) в разных органах [11] до активного поиска новых потенциальных клеточных источников внепанкреатического инсулина [7] и признания его важности в регуляции ряда процессов [3, 11, 15]. Несмотря на интерес исследователей, роль внепанкреатических ИПК в развитии СД2 и его осложнений, в частности в органах иммунопоэза, остается неясной.

Целью работы было оценить количество ИПК в селезенке у крыс с экспериментальным СД2.

Материалы и методы

Исследование проведено на 20 белых крысах-самцах линии Wistar возрастом 12-13 недель и средней массой 280±7 грамм, которые содержались в условиях вивария, получали гранулированный корм для лабораторных животных DeltaFeeds (АО «БиоПро», Россия) и имели неограниченный доступ к чистой питьевой воде. Все манипуляции с лабораторными животными проводились в соответствии с рекомендациями международных этических комитетов и Директивой Совета ЕС 2010/63/EU, на работу было получено разрешение этического комитета ИИФ УрО РАН № 10/23 от 09.10.2023. Для моделирования СД2 крысам внутрибрюшинно вводили раствор никотинамида (MilliporeSigma, США) в воде для инъекций (из расчета 110 мг/кг), а через 15 минут – раствор стрептозотоцина (MilliporeSigma, США) в цитратном буфере рН 4,5 в дозе 65 мг/ кг (данная модель является модификацией модели, предложенной Masiello P. и соавт. [12]). В качестве контроля использовали интактных животных аналогичного возраста. Через 30 суток после введения диабетогена у животных брали кровь из хвостовой вены натощак, после чего выводили из эксперимента декапитацией при ингаляционной анестезии изофлураном с предварительным внутримышечным введением ксилазина (Alfasan, Woerden, Нидерланды) в дозе 0,1 мг/кг и золетила-100 в дозе 5 мг/кг (Virbac, Carros, Франция). После проведения лапаротомии у крыс извлекали селезенку.

В плазме крови биохимически с использованием наборов реактивов фирмы АО «Витал Диагностикс» (Санкт-Петербург, Россия) определяли концентрацию глюкозы (глюкозооксидазным методом), аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ), методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора Rat Insulin ELISA kit (Thermo Fisher Scientific, США) – содержание инсулина. Относительное содержание гликированного гемоглобина (HbA1c) в цельной крови определяли методом аффинной гель-хроматографии с использованием набора реактивов ГЛИКОГЕМОТЕСТ (ООО «ЭЛТА», Москва, Россия). Значения индекса HOMA-IR рассчитывали по стандартной формуле.

Часть ткани селезенки фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине в течение 24 часов, после чего подвергали процедуре стандартной гистологической проводки с последующей заливкой в парафин и исследованию иммуногистохимически с использованием антител к проинсулину и инсулину (Anti-Insulin/Proinsulin, клон INS04+INS05, Invitrogen, США). Инсулин-позитивные клетки (ИПК) выявлялись при помощи светового микроскопа Leica TM 2500 (Leica Microsystems, Германия) по коричневому гранулярному окрашиванию цитоплазмы и подсчитывались с использованием программного обеспечения Leica Application Suite (Leica Microsystems, Германия). Функциональная активность ИПК оценивалась по оптической плотности цитоплазмы в инсулин-позитивной области с помощью программного обеспечения «ВидеоТесТ-Морфология» (Санкт-Петербург, Россия).

Для оценки состояния системы ПОЛ-АОЗ в гомогенатах селезенки определяли активность ферментов каталазы (КФ 1.11.1.6.) и супероксиддисмутазы (СОД) (КФ 1.15.1.1.), количество восстановленного глутатиона (GSH), а также содержание малонового диальдегида (МДА). Для этого ткань селезенки гомогенизировали в 0,1М фосфатно-солевом буфере рН 7,4 (соотношение ткани и буфера 1:100), после чего замораживали на длительное хранение при температуре -70 °С. Перед исследованием состояния системы СРО-АОЗ замороженные гомогенаты размораживали, затем центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Далее часть надосадка отбирали и разводили в физрастворе в соотношении 1 к 10. Использовали методы определения показателей ПОЛ-АОЗ, описанные в [1]. При выполнении биохимических методов анализа оптическую плотность измеряли на спектрофотометре DU-800 (Beckman Coulter, США). При проведении работ было использовано оборудование ЦКП ИИФ УрО РАН. Статистический анализ данных проводили с помощью программы OriginPro9.0 (OriginLab Corporation, США). Значимость различий между группами оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни, критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали p < 0,05.

Результаты и обсуждение

У крыс с экспериментальным СД2 наблюдалась умеренная гипергликемия, устойчивый характер которой подтверждался ростом концентрации в крови HbA1c, и увеличение значения индекса HOMA-IR (табл. 1), который отражает развитие инсулинрезистентности. Рост содержания в крови неспецифического маркера цитолиза АЛТ может свидетельствовать о повреждении органов у диабетических крыс (табл. 1).

Оксидативный стресс и воспаление являются основными факторами повреждения селезенки при развитии СД2. Накопление в ткани селезенки крыс с экспериментальным СД2 МДА на фоне отсутствия усиления активности каталазы и СОД и снижение количества GSH (табл. 2) свидетельствует о том, что система АОЗ не справляется с продуктами перекисного окисления, вследствие чего в ткани селезенки развивается окислительный стресс.

У интактных крыс без диабета в селезенке выявляется небольшое количество ИПК, причем большая их часть локализована в красной пульпе (рис. 1, см. 2-ю стр. обложки). У животных с экспериментальным СД2 количество ИПК в селезенке возрастает, при этом основное количество ИПК также локализовано в красной пульпе. Оценка оптической плотности цитоплазмы ИПК показывает усиление функциональной активности селезеночных ИПК при экспериментальном СД2.

 

ИЛЛЮСТРАЦИИ К СТАТЬЕ «ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ САХАРНЫЙ ДИАБЕТ ВТОРОГО ТИПА УВЕЛИЧИВАЕТ КОЛИЧЕСТВО ИНСУЛИН-ПОЗИТИВНЫХ КЛЕТОК В СЕЛЕЗЕНКЕ КРЫС» (АВТОРЫ: СОКОЛОВА К.В., ГЕТТЕ И.Ф., ТУКАНОВ Д.А., СТЕПАНЯН А.А., ДАНИЛОВА И.Г. [с. 7-12])

ILLUSTRATIONS FOR THE ARTICLE "Experimental type 2 diabetes increases the number of insulin-positive cells in rat spleen" (AuthorS: Sokolova K.V., Gette I.F., Tukanov D.A., Stepanyan A.A., Danilova I.G. [pp. 7-12])

Рисунок 1. Увеличение количества инсулин-позитивных клеток (ИПК) в селезенке крыс с экспериментальным СД2

Примечание. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование ткани селезенки с использованием антител к проинсулину и инсулину демонстрирует увеличение количества ИПК в селезенке крыс с экспериментальным сахарным диабетом 2-го типа (СД2) (А). Б – количество ИПК в красной и белой пульпе селезенки. А и Б – данные представлены в виде среднего ± ошибка среднего. В – ИПК в селезенке интактных крыс (1) и крыс с экспериментальным СД2 (2), ИПК обведены рамками. * – достоверность различий показателей с показателями интактных животных, рассчитанная согласно непараметрическому U-критерию Манна–Уитни, различия считаются достоверными и статистически значимыми при р < 0,05; интактные – показатели в группе крыс без диабета, СД2 – показатели в группе крыс с экспериментальным СД2; Н/мм2 – клеток на миллиметр квадратный среза ткани.

Figure 1. Increase in the number of insulin-positive cells (IPCs) in the spleen of rats with experimental T2D

Note. Immunohistochemical (IHC) examination of spleen tissue using antibodies to proinsulin and insulin demonstrates an increase in the number of IPCs in the spleen of rats with experimental type 2 diabetes mellitus (T2D) (A). B, the mass of IPCs in the red and white pulp of the spleen. A and B, data are presented as mean ± error of mean. C, IPCs in the spleen of intact rats (1) and rats with experimental T2D (2), IPCs are framed. *, significance of differences in indicators compared with the indicators of intact animals according to the non-parametric Mann–Whithey U test, the differences are considered reliable and statistically significant when p < 0,05; intact, indicators in the group of rats without diabetes; T2D, indicators in the group of rats with experimental T2DM; N/mm2, cells per millimeter square tissue section.

 

Увеличение количества ИПК в селезенке при экспериментальном СД2 согласуется с описанной в литературе способностью стволовых клеток селезенки дифференцироваться в продуцирующие инсулин â-клетки и корректировать гипергликемию в модели недостаточности инсулина, вызванной аллоксаном [2]. Интересно, что имплантированные грызунам с моделью диабета инсулин-продуцирующие клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток, мигрировали в селезенку, распределялись по ней и продуцировали инсулин, нормализуя гипергликемию [14].

Закономерно предположить, что регуляция образования и функционирования инсулин-продуцирующих клеток в органах иммунопоэза, к которым относится и селезенка, опосредуется со стороны как иммунной, так и эндокринной систем. Неизвестны задачи, решаемые организмом за счет внепанкреатической экспрессии инсулина, в частности образованием ИПК в селезенке. С одной стороны, экспериментальные данные свидетельствуют о том, что стволовые клетки селезенки выступают в качестве предшественников â-клеток [9] и позволяют предположить участие селезеночных ИПК в нормализации гликемии [2], но, с другой стороны, нельзя отбрасывать и возможную анаболическую роль внепанкреатического инсулина в тканях, подвергающихся негативному воздействию окислительного стресса. Известно, что изменение экспрессии генов является одним из путей адаптации организмов к изменению условий [6]. Мы предполагаем, что оксидативный стресс, сопровождающий гипергликемию и инсулинрезистентность, может вызвать усиление образования и функциональной активности ИПК в селезенке.

Заключение

Экспериментальный СД2 вызывает увеличение количества и функциональной активности ИПК в селезенке. Увеличение количества ИПК в селезенке наблюдается на фоне интенсификации окислительных процессов в органе.

×

About the authors

K. V. Sokolova

Ural Federal B. Yeltsin University; Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: xenia.socolova@gmail.com

PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Advanced Materials, Green Methods and Biotechnologies, Chemical-Technological Institute, Senior Research Associate, Laboratory of Morphology and Biochemistry

Russian Federation, Yekaterinburg; Yekaterinburg

I. F. Gette

Ural Federal B. Yeltsin University; Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: xenia.socolova@gmail.com

PhD (Biology), Senior Research Associate, Senior Research Associate, Laboratory of Morphology and Biochemistry

Russian Federation, Yekaterinburg; Yekaterinburg

D. A. Tukanov

Ural Federal B. Yeltsin University; Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: xenia.socolova@gmail.com

Laboratory Assistant/Researcher, Laboratory of Functional Design of Nanocluster Polyoxymetallates, Institute of Natural Sciences, Postgraduate Student

Russian Federation, Yekaterinburg; Yekaterinburg

A. A. Stepanian

Ural Federal B. Yeltsin University

Email: xenia.socolova@gmail.com

Student, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Institute of Natural Sciences

Russian Federation, Yekaterinburg

I. G. Danilova

Ural Federal B. Yeltsin University; Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: xenia.socolova@gmail.com

PhD, MD (Biology), Head, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Institute of Natural Sciences, Chief Research Associate, Laboratory of Morphology and Biochemistry

Russian Federation, Yekaterinburg; Yekaterinburg

References

  1. Емельянов В.В., Гетте И.Ф., Данилова И.Г., Сидорова Л.П., Цейтлер Т.А., Мухлынина Е.А. Влияние соединения класса 1,3,4-тиадиазинов на выраженность окислительного стресса при экспериментальном сахарном диабете 2 типа // Химико-фармацевтический журнал, 2023. Т.57, № 3. С. 20-24. [Emelianov V.V., Gette I.F., Danilova I.G., Sidorova L.P., Tseitler T.A., Mukhlynina E.A. Impact of a compound of the 1,3,4-thiadiazine class on the oxidative stress intensity in experimental type 2 diabetes mellitus. Khimiko-farmatsevticheskiy zhurnal = Chemical-Pharmaceutical Journal, 2023, Vol. 57, no. 3. pp. 20-24. (In Russ.)]
  2. Тимербулатов В.М., Фаязов P.P., Тимербулатов Ш.В., Сибиряк С.В., Саяпов М.М., Саубанов М.Н., Кулушев А.С. Изучение возможности коррекции экспериментальной инсулиновой недостаточности путем трансплантации клеточных культур селезеночной ткани // Медицинский вестник Башкортостана, 2007. № 1. C. 62-68. [Timerbulatov V.M., Fayazov R.R., Timerbulatov Sh.V., Sibiryak S.V., Sayapov M.M., Saubanov M.N., Kulushev A.S. Studying the possibility of correction of experimental insulin deficiency by splenic tissue cell culture transplantation. Meditsinskiy vestnik Bashkortostana = Medical Bulletin of Bashkortostan, 2007, no. 1, pp. 62-68. (In Russ.)]
  3. Aitken R.J., Curry B.J., Shokri S., Pujianto D.A., Gavriliouk D., Gibb Z., Whiting S., Connaughton H.S., Nixon B., Salamonsen L.A., Baker M.A. Evidence that extrapancreatic insulin production is involved in the mediation of sperm survival. Mol. Cell. Endocrinol., 2021, Vol. 526, pp. 111-193.
  4. Bhatti J.S., Sehrawat A., Mishra J., Sidhu I.S., Navik U., Khullar N., Kumar S., Bhatti G.K., Reddy P.H. Oxidative stress in the pathophysiology of type 2 diabetes and related complications: Current therapeutics strategies and future perspectives. Free Radic. Biol. Med., 2022, Vol. 184, pp. 114-134.
  5. Daryabor G., Atashzar M.R., Kabelitz D., Meri S., Kalantar K. The Effects of type 2 diabetes mellitus on organ metabolism and the immune system. Front. Immunol., 2020, Vol. 11, 1582. doi: 10.3389/fimmu.2020.01582.
  6. de Nadal E., Ammerer G., Posas F. Controlling gene expression in response to stress. Nat. Rev. Genet., 2011, Vol. 12, Iss. 12, pp. 833-845.
  7. GBD 2021 Diabetes Collaborators (Ong K.L., Stafford L.K., McLaughlin S.A., Boyko E.J., Vollset S.E. Global, regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet, 2023, Vol. 402, no. 10397, pp. 203-234.
  8. Habeeb M.A., Vishwakarma S.K., Habeeb S., Khan A.A. Current progress and emerging technologies for generating extrapancreatic functional insulin-producing cells. World J. Transl. Med., 2022, Vol. 10, no. 1, pp. 1-13.
  9. Kodama S., Davis M., Faustman D.L. Diabetes and stem cell researchers turn to the lowly spleen. Sci. Aging Knowledge Environ., 2005, Vol. 2005, Iss. 3, pe2. doi: 10.1126/sageke.2005.3.pe2.
  10. Kojima H., Fujimiya M., Matsumura K., Nakahara T., Hara M., Chan L. Extrapancreatic insulin-producing cells in multiple organs in diabetes. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2004, Vol. 101, no. 8, pp. 2458-2463.
  11. Maldonado M., Huang T., Yang L., Xu L., Ma L. Human umbilical cord Wharton jelly cells promote extra-pancreatic insulin formation and repair of renal damage in STZ-induced diabetic mice. Cell Commun. Signal., 2017, Vol. 15, no. 1, 43. doi: 10.1186/s12964-017-0199-5.
  12. Masiello P., Broca C., Gross R., Roye M., Manteghetti M., Hillaire-Buys D., Novelli M., Ribes G. Experimental NIDDM: development of a new model in adult rats administered streptozotocin and nicotinamide. Diabetes, 1998, Vol. 47, no. 2, pp. 224-229.
  13. Pinheiro-Machado E., Gurgul-Convey E., Marzec M.T. Immunometabolism in type 2 diabetes mellitus: tissue-specific interactions. Arch. Med. Sci., 2020, Vol. 19, no. 4, pp. 895-911.
  14. Ren M., Shang C., Zhong X., Guo R., Lao G., Wang X., Cheng H., Min J., Yan L., Shen J. Insulin-producing cells from embryonic stem cells rescues hyperglycemia via intra-spleen migration. Sci. Rep., 2014, Vol. 4, pp. 75-86.
  15. Saveria A., Mariaelena G., Emilia M., Stefania C., Sebastiano A. Autocrine regulation of insulin secretion in human ejaculated spermatozoa. Endocrinology, 2005, Vol. 146, no. 2, pp. 552-557.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. ILLUSTRATIONS FOR THE ARTICLE "EXPERIMENTAL TYPE 2 DIABETES INCREASES THE NUMBER OF INSULIN-POSITIVE CELLS IN RAT SPLEEN" (AUTHORS: SOKOLOVA K.V., GETTE I.F., TUKANOV D.A., STEPANYAN A.A., DANILOVA I.G. [pp. 7-12])

Download (641KB)
Indexing metadata
3. Supplement

Download (732KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Sokolova K.V., Gette I.F., Tukanov D.A., Stepanian A.A., Danilova I.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies