Suitability of a new diet-induced model of metabolic syndrome for immunophysiological studies in rats

Full Text

Введение

Метаболический синдром (МС), а также связанные с ним гипергликемия, инсулинорезистентность (ИР), дислипидемия и ожирение имеют чрезвычайно широкое распространение в человеческой популяции, являются факторами риска спектра серьезных патологий, в том числе сахарного диабета, сердечно-сосудистых заболеваний. Несмотря на большое количество исследований в данной области, патогенез возникновения и прогрессирования МС до конца не изучен. Участие клеток иммунной системы в патогенезе МС активно обсуждается, однако единой общей концепции по данному вопросу в настоящий момент не сформировано. Макрофаги, тучные клетки, различные виды лейкоцитов являются важным компонентом микроокружения, могут оказывать как местные, так и системные эффекты, продуцируют цитокины, факторы роста, протеазы, могут влиять на ремоделирование тканей, вовлекаясь в патогенез МС и его осложнений. Так, например, выявлены корреляции между активностью тучных клеток в подкожной жировой клетчатке, висцеральной и эпикардиальной жировой ткани и уровнем глюкозы, лептина, ИР, маркерами фиброза и повреждения эндотелия [1, 4, 5, 6]. Моделирование МС на лабораторных животных – важный инструмент в поиске механизмов его развития, который, однако, имеет и ряд ограничений. Применение моделей, не всегда отражающих патогенез МС у человека, использование разных видов лабораторных животных, наличие гендерных особенностей приводит зачастую к противоположным выводам относительно вклада иммунных клеток в развитие компонентов МС [3, 7]. Западная диета с высоким содержанием животных жиров, простых сахаров, соли и дефицитом пищевых волокон зарекомендовала себя как эффективный способ моделирования МС у крыс [2], при этом она хорошо отображает особенности питания современного человека, а значит более точно воспроизводит патогенетические основы МС. Однако известные способы ее моделирования предполагают использование зарубежных коммерческих высокожировых и высокоуглеводных кормов, доступ к которым заметно осложнен в настоящее время. Все это обуславливает необходимость отработки метода моделирования МС у лабораторных животных на основе вестернизированного рациона питания с использованием самостоятельно приготовленных кормов.

Цель исследования – оценить перспективность новой модификации рациона на основе западной диеты для моделирования метаболического синдрома у крыс.

Материалы и методы

Работа выполнена на 15 самках крыс линии Wistar в возрасте 8 недель. Крыс содержали в стандартных условиях вивария ИИФ УрО РАН. Все манипуляции с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами Директивы Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС. Исследование одобрено этическим комитетом ИИФ УрО РАН (протокол № 01-23 от 27 марта 2023).

Крысы контрольной группы (n = 7) получали стандартный коммерческий рацион («Дельта Фидс» (Арт. Лбк 120 С-19), АО «БиоПро», Россия). Крысы экспериментальной группы (n = 8) получали комбинированное питание с высоким содержанием насыщенных жиров, сахара и соли (так называемая «западная диета» [2] с некоторыми авторскими модификациями). Экспериментальный рацион готовили самостоятельно. Он включал в себя 30% стандартного коммерческого корма «Дельта Фидс», 25% свиного сала, 25% простых сахаров в виде сахарозы, 2% соли. Содержание белка доводили до 19% соевым протеином в соответствии с количеством белка в стандартном корме. Все животные имели свободный доступ к корму и воде. Еженедельно оценивали массу тела животных.

Через 18 недель в утренние часы после 12-часового голодания у крыс под наркозом (2% ксилазин (1 мл/кг) и золетил (3 мг/кг)) проводили взятие периферической крови из хвостовой вены в пробирки с антикоагулянтом К3-ЭДТА для проведения гематологического анализа, биохимического определения содержания глюкозы, гликированного гемоглобина, альбумина, мочевины, креатинина, триглицеридов (ТГ), общего холестерина, липопротеидов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ). Рассчитаны коэффициент де Ритиса как отношение активности АСТ и АЛТ в плазме крови, холестериновый коэффициент атерогенности как отношение разности концентраций общего холестерина и ЛПВП к концентрации ЛПВП, индекс триглицеридов-глюкозы как частное от деления произведения концентрации глюкозы и триглицеридов на два. Также измеряли массу тела, окружность талии, массу висцеральной жировой ткани (ВЖТ) и печени. Для оценки уровня ИР также проводили измерение концентрация инсулина в плазме крови при помощи набора реагентов Rat Insulin ELISA Kit (Sigma, RAB0904, США) и ИФА-анализатора Lazurite (Dynex Technologies, США). Индекс инсулинорезистентности HOMA-IR рассчитан как частное от деления произведения концентрации инсулина (мкЕд/мл) на содержание глюкозы (ммоль/л) и числа 22,5. Общий анализ крови выполняли при помощи гематологического анализатора Mindray BC-2800Vet (Mindray, Китай). Для оценки степени жировой дистрофии печени проводили гистохимическое окрашивание криостатных срезов печени на липиды при помощи красителя Oil Red O (Acros Organics, США). Анализ изображений проводили на микроскопе Leica DM2500 с видеокамерой Leica DFC420 при помощи программы Leica Application Suite v. 4.9. Подсчет количества липидных включений в гепатоцитах был проведен в 20 полях зрения у каждого животного.

Статистический анализ данных выполняли с помощью пакета прикладных статистических программ Statistica 10.0 (StatSoft, США). Данные представлены в виде среднего арифметического (M) и стандартной ошибки среднего (SEM). Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. При проверке статистических гипотез использовали 5%-ный уровень значимости.

Результаты и обсуждение

Полученные данные свидетельствуют, что применяемая экспериментальная диета с высоким содержанием насыщенных жиров, простых сахаров и соли вызывает повышение массы тела подопытных животных по сравнению с контролем с 6 недели экспозиции. Через 18 недель у крыс, получавших вестернизированное питание, масса тела, окружность талии, масса ВЖТ, индекс жировой ткани были значительно выше, чем у контрольных животных (табл. 1). При этом масса печени не изменяется. Развитие абдоминального ожирения принято считать главным критерием МС.

 

ТАБЛИЦА 1. Биометрические показатели крыс при моделировании метаболического синдрома (M±m)

TABLE 1. Biometric parameters of rats under metabolic syndrome modeling (M±m)

Показатель Parameter	Контроль Control	Западная диета Western diet
Длина тела, см Body length, cm	20,97±0,17	21,15±0,09
Окружность талии, см Waist circumference, cm	17,57±0,18	19,09±0,24*
Масса печени, г Liver weight, g	8,11±0,52	8,33±0,40
Масса ВЖТ, г VAT weight, g	16,50±1,22	28,97±1,12*
ИЖТ, % Adiposity index, %	6,14±0,42	9,86±0,19*
Масса тела, г Body weight, g	268,29±5,68	293,38±7,20*

Примечание. * – различия с контролем достоверны (U-тест Манна–Уитни, p < 0,05).

Note. *, significant differences with сontrol group (Mann–Whitney (U) test, p < 0.05).

 

По результатам гематологического анализа периферической крови у крыс, получавших 18 недель специальное питание, было выявлено снижение относительного содержания моноцитов (с 4,07±0,5 до 3,00±0,13), абсолютного содержания эритроцитов (с 8,50±0,22 до 7,86±0,16) гемоглобина (с 182,71±1,97 до 167,75±2,02), гематокрита (с 47,97±0,82 до 45,02±0,50), показателя гетерогенности эритроцитов (с 10,83±0,14 до 11,89±0,26). среднего объема тромбоцитов (с 6,37±0,07 до 5,96±0,06) и показателя гетерогенности тромбоцитов (с 16,01±0,09 до 15,65±0,06). Выявленные отклонения показателей, однако, не выходят за пределы физиологических значений. Наблюдаемые явления в эритроцитарном ростке, вероятно, можно связать с формирующимися изменениями функции печени, что находит отражение в снижении эритропоэза и увеличении гемолиза эритроцитов.

Биохимический анализ выявил у крыс, содержавшихся на западной диете, признаки нарушения углеводного обмена в виде повышения уровня глюкозы натощак (табл. 2) без значимого влияния на уровень гликированного гемоглобина. По-видимому, гипергликемия у экспериментальных животных не была длительной. Также у крыс при моделировании МС определяются признаки нарушения липидного обмена: повышено содержание ТГ и триглицерид-глюкозного коэффициента, снижено количество холестерина ЛПВП на фоне увеличения ЛПНП, ЛПОНП, коэффициента атерогенности (табл. 2). Общий холестерин остается на уровне контроля. Наблюдаемые изменения липидного профиля и гипергликемия натощак относятся к дополнительным критериям МС и факторами риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Содержание альбумина, АСТ, мочевины и креатинина в группе с западной диетой соответствуют контрольным значениям, что указывает на сохранение функций печени и почек. Несколько повышается АЛТ и, соответственно, снижается коэффициент де Ритиса (табл. 2), что может указывать на повреждение миокарда.

 

ТАБЛИЦА 2. Биохимические показатели плазмы крови крыс при моделировании метаболического синдрома (M±m)

TABLE 2. Biochemical parameters of rat blood plasma under metabolic syndrome modeling (M±m)

Показатель Parameter	Контроль Control	Западная диета Western diet
Глюкоза, ммоль/л Glucose, mmol/L	5,79±0,26	9,31±0,25*
HbA1c, %	4,48±0,21	4,65±0,10
АСТ, мкмоль/мин × л AST, µmol/min × L	15,87±0,62	15,70±0,81
АЛТ, мкмоль/мин × л ALT, µmol/min × L	10,46±0,39	12,54±0,55*
АСТ/АЛТ, у. е. AST/ALT, c. u.	1,52±0,05	1,26±0,07*
Альбумин, г/л Albumine, g/L	40,49±0,85	41,74±1,00
Мочевина, мкмоль/л Urea, µmol/L	4,76±0,17	5,14±0,15
Креатинин, мкмоль/л Creatinine, µmol/L	70,87±2,80	75,84±2,80
ХС общий, ммоль/л Cholesterol, mmol/L	1,72±0,07	1,63±0,05
ТГ, ммоль/л Triglycerides, mmol/L	0,13±0,01	0,29±0,02*
ЛПВП, ммоль/л HDL, mmol/L	1,44±0,09	1,11±0,05*
ЛПОНП, ммоль/л VLDL, mmol/L	0,06±0,01	0,12±0,01*
ЛПНП, ммоль/л LDL, mmol/L	0,22±0,05	0,41±0,04*
Коэффициент атерогенности, у. е. Atherogenic index, c. u.	0,21±0,05	0,49±0,06*
ТГ-коэффициент, у. е. Triglycerides-Glucose index, c. u.	0,37±0,04	2,23±0,21*
Инсулин, Ед/мл Insuline, U/mL	2,87±0,14	2,65±0,08
HOMA-IR, у. е. HOMA-IR, c. u.	0,74±0,04	1,10±0,05*

Примечание. * – различия с контролем достоверны (U-тест Манна–Уитни, p < 0,05).

Note. *, significant differences with сontrol group (Mann–Whitney (U) test, p < 0.05).

 

Специальная диета также приводит к снижению резистентности к инсулину, о чем свидетельствует повышение индекса HOMA-IR (табл. 2), хотя уровень инсулина натощак при этом остается в пределах нормы.

Применявшаяся диета не вызвала развития жирового гепатоза. Масса печени у крыс опытной группы не изменилась, биохимические и гистологические признаки цитолиза гепатоцитов, жировой дистрофии не были обнаружены.

Заключение

Используемая алиментарная модель МС на основе западной диеты наиболее полно отражает особенности питания современного человека. Выбранное соотношение компонентов и сроки экспозиции позволяют достигнуть развития у крыс абдоминального ожирения, повышения уровня ТГ, ЛПНП, гипергликемии натощак, ИР. При этом используемая диета не подходит для моделирования жирового поражения печени, что является лимитирующим фактором ее применения. Однако основной критерий МС в виде центрального ожирения, а также дополнительные критерии (дислипидемия, нарушение толерантности к глюкозе) воспроизводятся достаточно успешно, соответственно, предложенная модель перспективна для изучения функций иммунных клеток при развитии данных патологических изменений.

Благодарности

Авторы выражают благодарность ЦКП ИИФ УрО РАН за возможность использования научного оборудования.

About the authors

E. A. Mukhlynina

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: elena.mukhlynina@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Morphology and Biochemistry

Russian Federation, Yekaterinburg

K. O. Sozykin

LLC Citilab Ural

Email: elena.mukhlynina@yandex.ru

Doctor for Clinical Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Yekaterinburg

I. F. Gette

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: elena.mukhlynina@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Morphology and Biochemistry

Russian Federation, Yekaterinburg

References

Supplementary files