The effect of dehydroepiandrosterone on oxygen-dependent microbicidal activity of blood leukocytes in zymosan peritonitis in old rats

Full Text

Введение

Дегидроэпиандростерон (DHEA), как стероидный предшественник гормонов, является исходным соединением для биосинтеза андрогенов у мужчин и эстрогенов у женщин, его уровень существенно снижается при старении [8]. В последние годы в США проведено большое количество преклинических исследований, в которых было показано, что DHEA при пероральном применении эффективен для предупреждения развития и терапии заболеваний, связанных со старением, таких как злокачественные опухоли, атеросклероз, диабет, ожирение [8]. В системе in vitro DHEA ослабляет индуцированные липополисахаридами воспалительные реакции посредством активации Nrf2 в макрофагах RAW264.7 [4], ингибирует продукцию активных форм кислорода человеческими нейтрофилами, снижает продукцию IL-8 и уровень NF-êB, не влияя на образование нейтрофильных внеклеточных ловушек и экспрессию TLR4, стимулируя фагоцитоз бактерий Salmonella enterica серовар Typhimurium [3]. Однако влияние DHEA на функции фагоцитирующих клеток при развитии воспаления в условиях in vivo изучено недостаточно.

Цель работы – исследование влияния дегидроэпиандростерона на кислородзависимую микробицидность лейкоцитов крови при зимозановом перитоните у старых крыс.

Материалы и методы

Исследования выполнены на самцах белых нелинейных крыс в возрасте 3-6 месяцев (молодые крысы) и старше 1,5 лет (старые крысы). Животных содержали в стандартных условиях вивария (свободный доступ к воде и пище, 12-часовой световой день). Все исследования одобрены на соответствие нормам биомедицинской этики этическим комитетом при «ИЭГМ УрО РАН», протокол № 3 от 30.11.2015 г. В качестве основного подхода использовали экспериментальную модель зимозанового перитонита, ранее адаптированную нами для крыс [2]. DHEA (Sigma-Aldrich, США, кат. D 4000) вводили старым животным подкожно через день (всего 4 инъекции по 2 мг/кг массы тела, последнее введение за 24 ч до конца эксперимента). Контролем служили крысы того же возраста, получавшие по той же схеме растворитель DHEA (официнальное оливковое масло). За 12 ч до окончания эксперимента животным вводили стерильную суспензию предварительно прогретого в течение 60 мин на кипящей водяной бане зимозана (Zymosan A from Saccharomyces cerevisiae, Fluka, 97340) внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг. Животных выводили из эксперимента под наркозом.

Лейкоциты центральной крови (полученной методом декапитации с добавлением 50 ЕД гепарина/мл крови) выделяли методом седиментации с 0,1%-ной метилцеллюлозой (Sigma-Aldrich, США). После двукратного отмывания центрифугированием и подсчета абсолютного числа лейкоцитов в камере Нейбауэра (AC1000 Improved Neubauer, Hawksley, Великобритания) их концентрацию доводили до 25 × 10⁶ клеток в 1 мл. Кислородзависимую микробицидность перитонеальных фагоцитирующих клеток оценивали методом люминолзависимой хемилюминесценции. В стимулированном варианте в лунке планшета (3915 Assay Plate 96 Well Flat botton Black Polysterene, Corning Inc. Costar) смешивали 70 мкл раствора Хенкса без фенолового красного, 10 мкл натриевой соли люминола (Luminol sodium salt, Sigma-Aldrich, США, A4685-1G) на растворе Хенкса (конечная концентрация 2 × 10^-4 M), 10 мкл лейкоцитов крови (25 × 10⁶/мл) и 10 мкл опсонизированного или неопсонизированного зимозана (конечные концентрации 15 мкг/мл, 150 мкг/мл и 1500 мкг/мл). В спонтанном варианте смешивали те же компоненты, но вместо зимозана вносили 10 мкл раствора Хенкса. Измерение проводили на люминометре Luminoskan Ascent^® Thermo Labsystems (тип измерения – kinetic, integration time – 1000 ms, интервал – 3 мин, meas. count – 60) в течение 180 мин. Для статистического анализа использовали интегральный показатель хемилюминесценции за весь период измерения (integral, RLU).

Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики и апостериорного критерия Дункана (post-hoc Duncan’s test) для множественного сравнения между группами. Результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±m).

Результаты и обсуждение

Установлено, что у старых самцов крыс в сравнении с молодыми показатели хемилюминисценции статистически значимо повышаются при стимуляции лейкоцитов крови как опсонизированным (табл. 1), так и неопсонизированным зимозаном (табл. 2). Введение DHEA старым самцам крыс приводит к значительно выраженному снижению показателей хемилюминисценции в пробах со всеми концентрациями опсонизированного зимозана (см. табл. 1). При стимуляции лейкоцитов старых животных неопсонизированным зимозаном in vitro отмечается статистически значимое увеличение продукции активных форм кислорода, более выраженное при более низких концентрациях активатора (15 мкг/ мл и 150 мкг/ мл), в то время как при высокой концентрации зимозана этот эффект отменяется (см. табл. 2). Уровень спонтанной хемилюминисценции, отражающей активацию клеток in vivo, у старых крыс, получавших DHEA, выше в сравнении с молодыми животными. Обращает на себя внимание, что направленность изменений продукции активных форм кислорода в пробах с низкими концентрациями активатора in vitro повторяет эффекты DHEA у старых крыс в пробах со спонтанной хемилюминисценцией. Такие различия ответа лейкоцитов на опсонизированный и неопсонизированный зимозан могут быть связаны с различиями механизма действия этих флогогенов на клетки. Активация фагоцитирующих клеток опсонизированным зимозаном связана с распознаванием iC3b-фрагмента комплемента (CR3 и CR4) и Fc-фрагментов антител [1, 6, 7]. Неопсонизированный зимозан действует через паттернраспознающие рецепторы, в частности дектин-1 и другие бета-глюканраспознающие рецепторы, а также через TLR2 [5]. Хотя в классической эндокринологии долгое время доминирует представление о DHEA как метаболическом предшественнике для синтеза андрогенов и эстрогенов, данные исследований in vitro [3] указывают на возможность прямого гормонального действия этого соединения на клетки иммунной системы, что нуждается в дальнейших исследованиях. В целом проведенные исследования подтверждают наличие у DHEA выраженной иммуномодулирующей активности.

 

ТАБЛИЦА 1. ИНТЕГРАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЛЮМИНОЛЗАВИСИМОЙ ХЕМИЛЮМИНИСЦЕНЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ С ОПСОНИЗИРОВАННЫМ ЗИМОЗАНОМ В РАЗНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ У КРЫС ЧЕРЕЗ 12 Ч ПОСЛЕ ИНДУКЦИИ ЗИМОЗАНОВОГО ПЕРИТОНИТА, INTEGRAL RLU

TABLE 1. INTEGRAL PARAMETERS OF LUMINOL-DEPENDENT CHEMILUMINESCENCE OF BLOOD LEUKOCYTES WITH OPSONIZED ZYMOSAN IN DIFFERENT CONCENTRATIONS IN RATS 12 HOURS AFTER INDUCTION OF ZYMOSAN PERITONITIS, INTEGRAL RLU

Концентрация опсонизированного зимозана, мкг/мл Concentration of opsonized zymosan, microgram/mL	Номер группы и экспериментальное воздействие Group number and experimental exposure
	1. Молодые крысы + введение растворителя 1. Young rats + solvent injections n =13	2. Старые крысы + введение растворителя 2. Old rats + solvent injections n = 9	p2-1	3. Старые крысы + введение DHEA 3. Old rats + DHEA administration n = 10	p3-1	p3-2
0	17±4	37±10	> 0,05	60±18	= 0,018	> 0,05
15	201±44	837±240	= 0,002	463±75	> 0,05	= 0,048
150	464±139	1784±462	= 0,002	859±159	> 0,05	= 0,018
1500	432±101	997±200	= 0,006	448±82	> 0,05	= 0,006

Примечание. p_1-2, p_2-3, p_3-1 – показатели статистической значимости соответственно между 1-й и 2-й, 2-й и 3-й, 3-й и 1-й группами животных по критерию Дункана для множественного сравнения между группами; n – число животных.

Note. p_1-2, p_2-3, p_3-1 are levels of statistical significance, respectively, between the 1^st and 2^nd, 2^nd and 3^rd, 3^rd and 1^st groups of animals according to the Duncan criterion for multiple comparison between groups; n, number of animals.

 

ТАБЛИЦА 2. ИНТЕГРАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЛЮМИНОЛЗАВИСИМОЙ ХЕМИЛЮМИНИСЦЕНЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ С НЕОПСОНИЗИРОВАННЫМ ЗИМОЗАНОМ В РАЗНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ У КРЫС ЧЕРЕЗ 12 Ч ПОСЛЕ ИНДУКЦИИ ЗИМОЗАНОВОГО ПЕРИТОНИТА, INTEGRAL RLU

TABLE 2. INTEGRAL PARAMETERS OF LUMINOL-DEPENDENT CHEMILUMINESCENCE OF BLOOD LEUKOCYTES WITH NON-OPSONIZED ZYMOSAN IN DIFFERENT CONCENTRATIONS IN RATS 12 HOURS AFTER INDUCTION OF ZYMOSAN PERITONITIS, INTEGRAL RLU

Концентрация неопсонизированного зимозана, мкг/мл Concentration of non-opsonized zymosan, microgram/mL	Номер группы и экспериментальное воздействие Group number and experimental exposure
	1. Молодые крысы + введение растворителя 1. Young rats + solvent injections n = 13	2. Старые крысы + введение растворителя 2. Old rats + solvent injections n = 9	p2-1	3. Старые крысы + введение DHEA 3. Old rats + DHEA administration n = 10	p3-1	p3-2
0	17±4	37±10	> 0,05	60±18	= 0,018	> 0,05
15	97±30	203±32	> 0,05	356±63	= 0,018	= 0,0003
150	122±40	345±72	= 0,035	488±101	> 0,05	= 0,002
1500	156±72	583±156	= 0,010	295±96	> 0,05	> 0,05

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

Заключение

Таким образом, в настоящей работе установлено, что старение самцов крыс приводит к выраженной провоспалительной активации продукции активных форм кислорода лейкоцитами крови на высоте воспаления, индуцированного введением зимозана. Введение DHEA старым самцам крыс статистически значимо снижает продукцию активных форм кислорода лейкоцитами крови при активации лейкоцитов in vitro опсонизированным зимозаном, но стимулирует продукцию радикалов кислорода в пробах без зимозана, а также при воздействии неопсонизированного зимозана в концентрациях 15 и 150 мкг/ мл.

About the authors

S. Y. Barkov

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; E. Wagner Perm State Medical University

Email: jshilov@mail.ru

PhD Student, Laboratory of Ecological Immunology, Senior Laboratory Assistant, Department of Immunology

Russian Federation, Perm; Perm

Y. I. Shilov

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; E. Wagner Perm State Medical University; Perm State University

Author for correspondence.
Email: jshilov@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Senior Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology, Associate Professor, Department of Immunology, Associate Professor, Department of Microbiology and Immunology

Russian Federation, Perm; Perm; Perm

S. Y. Shilov

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; E. Wagner Perm State Medical University

Email: jshilov@mail.ru

PhD (Medicine), Junior Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology, Associate Professor, Department of Normal Physiology

Russian Federation, Perm; Perm

References

Supplementary files