Analysis of СD4⁺CD8⁺ double-positive T cell subpopulations in the patients with immunodeficiencies

Full Text

Введение

Ранее считалось, что экспрессия корецепторов СD4 и CD8 являлась взаимоисключающей на зрелых Т-лимфоцитах и СD4⁺CD8⁺ дубль-позитивные Т-лимфоциты (ДПТЛ) были не более чем стадией созревания Т-клеток в тимусе. Однако на сегодняшний день известно, что ДПТЛ – это гетерогенная группа клеток с разным уровнем экспрессии корецепторов и с различными вариантами цепей молекулы CD8. Различают следующие фенотипы: CD4⁺CD8⁺CD3^-TCRαβ^loCD69^-CD5^lo и CD4⁺CD8⁺CD3^-TCRαβ^hiCD69^-CD5⁺ (преимущественно локализуются в корковом слое тимуса), CD4^Bright+CD8^dim+, CD4^Bright+CD8αα^dim+ [1, 2, 7], CD4^Bright+CD8αα^dim+, CD4⁺CD8αβ⁺ [12] с различной локализацией их в организме человека. Так, например, ДПТЛ в норме в качестве минорной субпопуляции от общего пула Т-лимфоцитов обнаруживаются на периферии: печень (5,5%), кишечник (~14%), лимфоидная ткань, кожа, кровь (3%) и как мажорная – в тимусе до 75% [1, 7]. Исходя из этого, существуют центральная и периферическая теории происхождения ДПТЛ, связанные либо с преждевременным выходом незрелых лимфоцитов из тимуса, либо с активацией цитотоксических или хелперных Т-лимфоцитов. Предполагается, что клетки с фенотипом CD4⁺CD8αβ⁺ имеют тимическое происхождение, так как на данных клетках отсутствует экспрессия гена TdT (продукт гена – терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза – это ДНК-полимераза, экспрессируемая в незрелых, прe-B-, пре-T-лимфоцитах), CD1 и снижается экспрессия фактора RAG-1 (ген 1, активирующий рекомбинацию), что характерно только для клеток, подвергающихся отрицательной селекции в тимусе – одного из этапов созревания клеток [12]. Также при сочетанной экспрессии факторов транскрипции Runx3 и ThPOK, которые строго регулируют направление дифференцировки, соответственно, в СD8⁺ или CD4⁺Т-лимфоциты, в тимусе будет сохраняться дубль-позитивность этих клеток с последующей возможностью выхода ДПТЛ на периферию. Однако экспериментальные работы in vitro в большей степени подтверждают приобретение корецепторов непосредственно на периферии, так молекула CD4 экспрессируется на СD8⁺ клетках (фитогемагглютинин, IL-4, ретиноевая кислота, TGF-β) или СD8 на СD4⁺ клетках (стафиллококковый энтеротоксин, анти-CD3 моноклональное антитело, анти-CD28 моноклональное антитело, TGF-β, IL-7 и IFNγ) при стимуляции различными веществами [7, 8]. При этом роль и функция данных клеток вне зависимости от их происхождения до сих пор не изучена. Гипотетически, исходя из того, какой рецептор CD8 или CD4 на клетке будет иметь подавляющую плотность и уровень экспрессии, фенотипически различные ДПТЛ будут либо осуществлять цитолиз, либо участвовать в регуляции иммунного ответа, синтезируя различные растворимые факторы типа интерферонов, интерлейкинов (например, IL-2, IL-4, IL-10), фактора некроза опухоли [1, 6]. Так, например, исследования на мышах показали, что CD4⁺CD8αα⁺ клетки могут выполнять регуляторные функции продуцируя противовоспалительные цитокины IL-10 и TGF-β, а также IFNγ. Среди всех фенотипов ДПТЛ выделяют и тот, который продуцируют перфорин-гранзим, при этом содержание данных цитотоксических белков было выше или сопоставимо с таковым в клетках CD8⁺, что позволяет предположить, что популяция дубль-позитивных клеток может привести к быстрому лизису инфицированных вирусом клеток [3]. Таким образом, представленная информация позволяет предположить, что CD4⁺CD8⁺ дубль-позитивные-Т-клетки могут играть важную роль в регуляции иммунных реакций патологических состояниях. Интересно, что при патологии данная субпопуляция клеток также локализуются в различных органах и тканях, особенно инфицированных вирусом (ВИЧ, гепатит, ВЭБ, COVID-19) [7, 10, 11]. Сообщается, что увеличение количества ДПТЛ наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, паразитозах, онкологии, например при лимфоме Ходжкина, Т-клеточной лимфоме, раке молочной железы, гепатоцеллюлярной карциноме, меланоме и др., при атопических заболеваниях [2, 5, 13, 14, 15]. При изучении патогенезов данных заболеваний за последние годы фокус внимания исследователей переключился на изучение минорных субпопуляций, их количества, пластичности, механизмов вовлечения в иммунный ответ. Поскольку количество ДПТЛ меняется при аллергических, аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваниях, то следует полагать, что и при еще одном патологическом состоянии иммунной системы – иммунодефициты (ИД), мы можем наблюдать изменения количества этих клеток. ИД – то генетически детерминированное (первичный ИД – ПИД) или приобретенное (вторичный ИД – ВИД) состояние иммунной системы, при котором в силу разных причин имеются нарушения иммунологической реактивности, обусловленные выпадением одного или нескольких звеньев иммунного аппарата или тесно взаимодействующих с ним неспецифических факторов защиты организма, приводящие к снижению резистентности к инфекционным заболеваниям. Однако практически отсутствует информация в литературных источниках касательно количества ДПТЛ и их патогномичной роли при ИД, поэтому представляет собой значительный интерес проанализировать данную субпопуляцию клеток при данной иммунопатологии.

Материалы и методы

В основу работы положен ретроспективный анализ медицинской документации 120 пациентов в возрасте от 20 до 90 лет, проходивших лечение в иммунологическом отделении клиники иммунопатологии НИИФКИ за 2022 г. На момент поступления в клинику каждому из пациентов проводился анализ иммунологических показателей с помощью проточной цитометрии. Для проведения исследования были выделены две группы: пациенты-мужчины (n = 60, средний возраст 44,5 ± 14,7) и женщины (n = 60, средний возраст 47,9 ± 17,2). В группах учитывались следующие показатели: наличие диагноза вторичного структурного, комбинированного или функционального иммунодефицита, обусловленного наличием очагов хронической инфекции и/или нарушением нейрогенной регуляции и/или метаболической дисфункции, перманентное течение (D89.8), относительное количество CD4⁺CD8⁺ дубль-позитивных лимфоцитов, возраст пациентов, сопутствующие заболевания, дефицит витаминов. К сопутствующим заболеваниям относили инфекции, паразитозы, атопические заболевания, метаболические синдромы по типу нарушения белково-углеводного или жирового обмена. Из исследования исключались пациенты с наличием вторичного иммунодефицита, развившегося на фоне онкологии или ВИЧ-инфекции, а также с наличием установленного диагноза первичного иммунодефицита. В исследовании также выделялись отдельные подгруппы среди мужчин и женщин по следующим часто встречающимся критериям: 1. наличие золотистого стафилококка в зеве, подтвержденного микробиологическим исследованием мазка; 2. реконвалесценты новой короновирусной инфекции (НКВИ) и/или наличие постковидного синдрома (U09.9 – состояние после COVID-19); 3. наличие дефицита витамина Д, 4. наличие лямблиоза кишечной или смешанной формы, 5. наличие ПЦР⁺ вирусной инфекции.

1-я группа – мужчины, из 60 пациентов 3 имели диагноз «первичный иммунодефицит» и 2 – «вторичный иммуннодефицит», 1 на фоне множественной миеломы IgG/капДа|ст. SS и 1 на фоне ВИЧ-инфекции. Из 56 пациентов только 15 мужчин имели повышенный уровень ДПТЛ. Подгруппы:

1.1. 11 пациентов с носительством золотистого стафилококка, из них 4 имели повышенное количество ДПТЛ.

1.2. 12 пациентов имели статус реконвалесцента НКВИ и/или постковидный синдром, при этом относительное количество ДПТЛ находились в пределах референсных значений.

1.3. у 28 пациентов обнаруживался лямблиоз (15 чел.) и/или дефицит витамина Д (15), из них 9 пациентов имели повышенный уровень ДПТЛ в крови (3 из них – дефицит вит. D, 7 – с лямблиозом).

1.4. 24 пациента имели ПЦР⁺ на вирусную инфекцию, из них 8 вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ), 2 – вирусный гепатит Б (ВГБ), 2 – вирусный гепатит С (ВГС), 7 – вирус простого герпеса (ВПГ), 4 – вирус герпеса 6-го типа (ВГ6), 1 – вирус папилломы человека (ВПЧ).

2-я группа – женщины, из 60 пациентов 3 имели диагноз «первичный иммунодефицит», 2 – вторичный иммунодефицит: 1 на фоне хронического лимфолейкоза стадия А по Binet без показаний к терапии, 1 на фоне множественной миеломы с секрецией легких цепей лямбда-типа в сочетании с AL-амилоидозом с преимущественным поражением почек. Из 57 пациентов только 18 женщин имели повышенный уровень ДПТЛ. Подгруппы:

2.1. 9 пациентов с носительством золотистого стафилококка, из них 5 имели повышенное количество ДПТЛ.

2.2. 17 пациентов имели статус реконвалесцента НКВИ и/или постковидный синдром, при этом относительное количество ДПТЛ находилось в пределах референсных значений, за исключением 2 пациентов.

2.3. у 24 пациентов обнаруживался лямблиоз (15 чел.) и/или дефицит витамина Д (14), из них 9 пациентов имели повышенный уровень ДПТЛ в крови (наоборот, 7 из них – дефицит вит. D, 3 – с лямблиозом).

2.4. 27 пациентов имели ПЦР⁺ на вирусную инфекцию, из них 1 – вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ), 1 – вирусный гепатит B (ВГB), 1 – вирусный гепатит С (ВГС), 19 вирус простого герпеса (ВПГ), 4 – вирус герпеса 6-го типа (ВГ6), 1 – вирус папилломы человека (ВПЧ), 3 – вирус варицелла-зостер (ВЗ).

В выборке отсутствовали пациенты, у которых значения количества ДПТЛ было равным 0.

Анализ результатов и статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Prizm 9.0.0 с использованием one-way ANOVA и критерия Манна–Уитни. Результаты представлены в виде медианы, нижнего квартиля и верхнего квартиля – Me (Q_0,25-Q_0,75). Различия считали достоверно значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Из всех пациентов с ВИД, которым проводилось исследование дубль-позитивных Т-лимфоцитов, в среднем около 29,2% имели повышенный уровень этих клеток (26,7% у мужчин, 32,1% у женщин). При этом повышение относительного количества ДПТЛ было статистически значимо, как в группах мужчин (рис. 1А), так и женщин (рис. 1Б), однако достоверных различий по количеству ДПТЛ у мужчин и женщин не было обнаружено (рис. 1В). Хотя в литературных источниках имеются данные о половом диморфизме в отношении ДПТЛ условно-здоровых доноров, так, например, у женщин количество ДПТЛ было выше, чем у мужчин [6]. На наш взгляд отсутствие таких изменений обусловлено наличием у пациентов иммунопатологии, обусловленной наличием очагов хронической инфекции. Далее мы продемонстрировали, что в зависимости от возраста у женщин и мужчин с ВИД количество ДПТЛ различалось. Так, например, у женщин достоверно значимо увеличилось содержание ДПТЛ в крови в возрастной группе от 20 до 30 лет по сравнению с другими возрастными периодами (рис. 2А), а у мужчин же наблюдалась тенденция, при которой значения ДПТЛ было выше в возрасте от 30 до 40 лет (p = 0,06) (рис. 2Б). Интересно, что в норме с возрастом количество ДПТЛ в периферической крови, наоборот, увеличивается [4], хотя у пациентов мы видим другое распределение ДПТЛ со сдвигом значительного количества клеток в сторону молодого возраста. Возможно, данная субпопуляция клеток в большей степени вовлечена в процессы иммунорегуляции при патологии.

 

Рисунок 1. Относительное количество CD4⁺CD8⁺ дубль-позитивных Т-лимфоцитов у пациентов со вторичными иммунодефицитами в зависимости от пола (А – мужчины, у которых количество клеток в пределах референсных значений n = 39 – норма, повышенное количество n = 15 – выше нормы; Б – женщины, у которых количество клеток в пределах референсных значений n = 39 – норма, повышенное количество n = 15 – выше нормы; В – сравнение количества клеток у мужчин и женщин)

Примечание. Данные представлены как медиана ± межквартильный размах; * – статистически значимые различия p < 0,05, тест Манна–Уитни.

Figure 1. Relative number of CD4⁺CD8⁺ double-positive T lymphocytes in patients with immunodeficiencies according to sex (A, men, the number of cells within the reference values n = 41 is normal, increased number n = 15 is above the norm; B, women, the number of cells within the reference values n = 39 is normal, increased number n = 18 is above the norm; С, comparison of the number of cells in men and women)

Note. Data are presented as median ± interquartile range. *, significant differences p < 0.05 by employing Mann–Whitney test.

 

Рисунок 2. Относительное количество CD4⁺CD8⁺ дубль-позитивных Т-лимфоцитов у пациентов со вторичными иммунодефицитами в зависимости от возраста (А – женщины, n = 18; Б – мужчины, n = 15)

Примечание. Данные представлены как медиана ± межквартильный размах. * – статистически значимые различия p < 0,05, однофакторный дисперсионный анализ, тест Краскела–Уоллиса.

Figure 2. Relative number of CD4⁺CD8⁺ double-positive T lymphocytes in patients with s immunodeficiencies according to age (A, women, n = 18; B, men, n = 15)

Note. Data are presented as median ± interquartile range. *, statistically significant differences p < 0.05, one-way ANOVA, Kruskal–Wallis test.

 

Поскольку среди пациентов с ВИД имеются пациенты с повышенным количеством ДПТЛ в периферической крови, мы выявили наиболее общие и часто встречающиеся признаки у данных пациентов, которые могли бы повлиять на изменение содержания ДПТЛ. Однако, что у мужчин, что у женщин, дефицит витамина D, обсеменение золотистым стафилококком и ассоциированные с ним заболевания ротоглотки, лямблиоз, постковидный синдром и статус реконвалесцента НКВИ не являются индикаторами изменения количества клеток, как повышенные, так и нормальные значения CD4⁺CD8⁺ дубль-позитивных клеток встречаются примерно с одинаковой частотой в этих группах, что требует более тщательного отбора критериев у пациентов.

У пациентов с ВИД в группе мужчин (рис. 3) наиболее частыми хроническими вирусными инфекциями с повышенной долей ДПТЛ были вирусные гепатиты С и B (у всех пациентов с подтвержденными гепатитами количество ДПТЛ было выше референсных значений) и вирус Эпштейна–Барр. Известно, что у пациентов с хроническими вирусными гепатитами наблюдается повышение уровня ДПТЛ, при этом данные клетки высоко экспрессируют молекулы истощения Tim-3 [9]. Примечательно, что лишь у одного пациента с вирусом простого герпеса наблюдалось изменение количества клеток (~14%).

 

Рисунок 3. Доля CD4⁺CD8⁺ дубль-позитивных Т-лимфоцитов у пациентов со вторичными иммунодефицитами в зависимости от наличия вирусной инфекции (EBV – вирус Эпштейна–Барр, HBV – вирус гепатита Б, HSV – вирус простого герпеса, HHV-6 – вирус герпеса человека 6-го типа, CMV – цитомегаловирус, VPH – вирус папилломы человека, HCV – вирус гепатита С, VZ – вирус ветряной оспы)

Figure 3. The proportion of CD4⁺CD8⁺ double-positive T lymphocytes in patients with immunodeficiencies according to the presence of a viral infection (EBV, Epstein–Barr virus; HBV, hepatitis B virus; HSV, herpes simplex virus; HHV-6, human herpes virus type 6; CMV, cytomegalovirus; VPH, human papillomavirus; HCV, hepatitis C virus; VZ, varicella zoster virus)

 

В группе женщин (рис. 3, см. 2-ю стр. обложки) с вирусом Эпштейна–Барр и вирусом папилломы человека наблюдалось увеличение доли ДПТЛ, при этом малая доля ДПТЛ приходилась на пациентов с вирусом простого герпеса около 10%. Мы предполагаем, что повышение количества ДПТЛ напрямую связано с реализацией противовирусного иммунного ответа и приобретением корецепторных молекул CD4 или CD8 на периферии, что согласовывается с данными из литературы. Следует отметить, что количество клеток было повышено не при всех вирусных инфекциях, что требует дальнейшего более детального изучения с точки зрения формирования иммунного ответа против конкретного семейства или даже штамма вирусов как в фазу обострения, так и в фазу реконвалесценции.

К тому же в половине случаев повышения относительного количества ДПТЛ у пациентов с ВИД в анамнезе регистрировались атопические заболевания. Известно, что ДПТЛ способны вызывать поляризацию наивных CD4⁺T-клеток в сторону Th2, сдерживая при этом индукцию Th1 [1], эти данные подчеркивают наличие иммунорегуляторного механизма, который может являться ключевым звеном в иммунопатогенезе атопических заболеваний, особенно с тяжелым течением.

Выводы

Таким образом, при ВИД зафиксировано повышение количества ДПТЛ, однако неоднозначны причины изменения численности данной субпопуляции клеток. Одной из явных причин является наличие у пациентов хронической вирусной инфекции, такой как вирус Эпштейна–Барр, вирусные хронические гепатиты, вирус папилломы человека. Необходимо продолжать исследования в области изучения роли и причин изменения количества CD4⁺CD8⁺ дубль-позитивных Т-лимфоцитов при физиологических и патологических состояниях, поскольку, оказывая на них влияние, потенциально можно регулировать эффекторные механизмы имунного ответа.

About the authors

A. A. Aktanova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology; Novosibirsk State Medical University

Author for correspondence.
Email: aktanova_al@mail.ru

Junior Researcher, Laboratory of Clinical Immunopathology; Assistant Professor, Department of Immunology

Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

O. S. Boeva

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: aktanova_al@mail.ru

PhD Student, Assistant Researcher, Laboratory of Clinical Immunopathology

Russian Federation, Novosibirsk

E. O. Skribacheva

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: aktanova_al@mail.ru

Resident

Russian Federation, Novosibirsk

I. P. Skachkov

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology; Novosibirsk State Medical University

Email: aktanova_al@mail.ru

Student; Assistant Researcher, Laboratory of Regulation of the Immune Response

Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

N. V. Pronkina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: aktanova_al@mail.ru

PhD (Biology), Medical Technologist, Head, Laboratory of Clinical Immunology of CI

Russian Federation, Novosibirsk

I. V. Meledina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: aktanova_al@mail.ru

PhD (Medicine), Allergist, Immunologist, Acting Deputy, Chief Physician for Medical Affairs, Head, Immunology Department of CI

Russian Federation, Novosibirsk

O. I. Zheltova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: aktanova_al@mail.ru

PhD (Medicine), Allergist, Immunologist of CI

Russian Federation, Novosibirsk

O. L. Krugleeva

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology; Novosibirsk State Medical University

Email: aktanova_al@mail.ru

PhD (Medicine), Allergist, Immunologist of CI; Acting Head, Associate Professor, Department of Immunology

Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

V. A. Kozlov

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: aktanova_al@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Full Member, Russian Academy of Sciences; Head, Laboratory of Clinical Immunopathology, Scientific Director

Russian Federation, Novosibirsk

References

Supplementary files