Detection of allergen-specific Th2A-cells in peripheral blood of patients with allergic diseases

Full Text

Введение

Распространенность аллергических заболеваний по данным эпидемиологических исследований в России достигает 15-35% [1], и сохраняется тренд к увеличению заболеваемости с каждым годом на 1,5-3%. Уже сейчас аллергические заболевания в мире занимают третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, по прогнозам ВОЗ к 2050 году половина населения земного шара будет страдать от аллергии. Наиболее распространенными среди аллергических заболеваний являются аллергический ринит, атопический дерматит и бронхиальная астма, во всем мире диагноз верифицирован более чем у 400 млн, 230 млн и 330 млн человек соответственно [6].

На развитие и течение аллергических заболеваний влияют разные факторы. К факторам окружающей среды следует отнести активность сезона поллинации (количество единиц пыльцы деревьев/сорных трав в воздухе), загрязнение воздуха выхлопными газами, питьевой воды, почвы примесями и химическими соединениями, табачный дым, применение в продуктах питания различных синтетических химических соединений, которые могут выступать аллергенами. Немаловажную роль играют генетические факторы, определяющие характер реагирования иммунной системы на аллерген и повышающие предрасположенность к атопии [3]. В последнее время выделяют также эпигенетические факторы (ДНК-метилирование, модификация гистонов, некодирующие РНК), которые способствуют продукции IgE и Th2-цитокинов, модифицируют реакцию на аллерген [9]. Кроме того, известно, что аллергические заболевания могут постепенно прогрессировать. Пищевая аллергия и атопический дерматит, появившиеся в младенчестве, без должной терапии постепенно переходят с возрастом в бронхиальную астму и аллергический ринит [4]. Это происходит за счет вовлечения в аллергический процесс слизистой оболочки и распространения на другие органы, данный процесс получил называние «атопический марш» [10].

В патогенез аллергических заболеваний вовлечены клетки иммуной системы (Т-лимфоциты, В-лимфоциты, моноциты, макрофаги, клетки врожденного иммунитета ILC, дендритные клетки, эозинофилы, тучные клетки) и клетки слизистой оболочки, кожи, гладкой мускулатуры бронхов, а также различные продуцирцемые клетками активные молекулы и цитокины [9]. Несмотря на различия в проявляющихся симптомах, в основе патогенеза всех аллергических заболеваний лежит активация Th2-звена иммунного ответа.

На стадии сенситизации к аллергену реализуется образование фолликулярных Т-хелперных клеток, сохраняющихся в близлежащих лимфотических узлах, а при последующем попадании аллергена в организм происходит накопление эффекторных аллерген-специфических Th2-клеток. Популяция Т-клеток, отвечающих на аллергены, достаточно гетерогенна. Некоторые исследователи выделяют различные субпопуляции Th2-клеток в зависимости от уровня экспрессии поверхностных маркеров, отражающих стадию дифференцировки клеток, их эффекторную функцию и способность к миграции, а также по уровню продукции Th2-цитокинов. Недавно группой исследователей у пациентов с аллергией на пыльцу тимьяна с применением технологии тетрамер pMHCII была выделена и охарактеризована отдельная популяция терминально дифференцированных аллерген-специфических Т-клеток, которые ко-экспрессировали CRTh2 и CD161 [8]. В исследованиях in vitro и на образцах крови пациентов с помощью транскриптомного анализа было установлено, что клетки с данным фенотипом инициируют патогенетический ответ при аллергическических заболеваниях и продуцируют на более высоком уровне IL-5 и IL-9 по сравнению с Th2-лимфоцитами [8], поэтому данная популяция получила название проаллергические «Th2A» клетки.

Целью данной работы было исследовать содержание аллерген-специфических Th2A-клеток и Th2-лимфоцитов при аллергической бронхиальной астме, атопическом дерматите и аллергическом рините.

Материалы и методы

В исследование вошли 10 пациентов с аллергическим ринитом, находящихся вне обострения, вне сезона поллинации, перед началом проведения курса АСИТ причинными аллергенами (средний возраст 33±2,4 года, 4 женщины и 6 мужчин), 9 пациентов с атопическим дерматитом перед проведением генно-инженерной терапии биолгическими препаратами (средний возраст 34±3,5 года, 6 женщин и 3 мужчины), 12 пациентов с аллергической БА перед проведением генно-инженерной терапии биологическими препаратами (средний возраст 49±3,9 года, 8 женщин и 4 мужчины), и 8 условно здоровых доноров (средний возраст 32±3,8 года, 7 женщин и 1 мужчина) без аллергопатологии. Набор в исследование осуществлялся после подписания информированного согласия. Пациенты находились в отделении аллергологии клиники иммунопатологии НИИФКИ (г. Новосибирск), забор крови от пациентов осуществлялся перед проведением терапии. Пациенты преимущественно имели поливалентную сенсибилизацию к пыльцевым, бытовым, эпидермальным, плесневым аллергенам. По степени контроля, определяемой согласно опроснику АСТ, у пациентов с астмой было неконтролируемое течение заболевание (11,9±0,6 балла) и тяжелая степень тяжести бронхиальной астмы. Пациенты с аллергическим ринитом согласно опроснику RCAT характеризовались неконтролируемым течением ринита (20±1,9 балла) и имели легкую и среднюю тяжесть заболевания. У всех пациентов с атопическим дерматитом согласно индексу SCORAD фиксировалось тяжелое течение заболевания (71,9±4,3 балла).

Получение клеток периферической крови и подготовка клеток для цитометрического анализа

Выделение мононуклеарных клеток (МНК) осуществляли методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (p = 1,082 г/л) (BioClot GmbH, Германия).

Аллерген-специфические Th2A-клетки фенотипировали как CD4⁺CD45RO⁺CD27^-CRTh2⁺CD161⁺ лимфоциты, а Th2-лимфоциты как CD4⁺CD45RO⁺CRTh2⁺ клетки. МНК периферической крови после выделения окрашивали моноклональными антителами (BioLegend, США), конъюгированными с флуорохромами, против поверхностных маркеров CD4-FITC, CD45RO-PE/Cy7, CD27- APC/ Cy7, CD294 (CRTh2)-APC, CD161- PE. Для определения негативной популяции для CD161 и CD294 использовали FMO (Fluorescence Minus One) контроли, т. е. клетки окрашивали всеми антителами из панели за исключением антител к CD161 и CD294.

Анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACS CantoII (Becton Dickenson, США) в программном обеспечении FACS Diva 6.0 (Becton Dickenson, США).

Статистическая обработка

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакета прикладной программы GraphPadPrism 9 (GraphPad Software, США). Поскольку распределение показателей не всегда соответствовало нормальному распределению согласно критерию Шапиро–Уилка, применялись методы непараметрической статистики. Для множественого сравнения несвязанных переменных использовали критерий Краскела–Уоллиса, с последующим применением парного критерия Манна–Уитни. Выявленные отличия считали достоверными при уровне значимости p < 0,01.

Результаты и обсуждение

Первоначально мы оценили количество Th2-лимфоцитов в периферической крови доноров и пациентов, клетки мы фенотипировали как CD4⁺CD45RO⁺CRTh2⁺ лимфоциты. Множественный анализ тестом Краскела–Уоллиса показал, что медианы показателей в группах достоверно не различаются (p = 0,136). Последующее попарное сравнение показателей также не выявило достоверных отличий по количеству Th2-лимфоцитов как между показателем доноров и показателями во всех группах пациентов с аллергическими заболеваниями, так и между группами пациентов с различными аллергическими заболеваниями (рис. 1).

 

Рисунок 1. Содержание Th2-клеток в норме, при аллергическом рините, атопическом дерматите и бронхиальной астме

Примечание. D – доноры, AR – пациенты с аллергическим ринитом, AD – пациенты с атопическим дерматитом, BA – пациенты с бронхиальной астмой. За 100% принято число CD4⁺CD45RO⁺ клеток. Данные представлены в виде медианы и итерквартильного интервала (25^-й-75^-й перцентили).

Figure 1. Content of Th2-cells in norm, allergic rhinitis, atopic dermatitis and bronchial asthma

Note. D, healthy individuals; AR, patients with allergic rhinitis; AD, patients with atopic dermatits; BA, patients with bronhial asthma. The number of CD4⁺CD45RO⁺ cells was taken as 100%. The data are present as Median with the interquartile range (25^th-75^th percentiles).

 

Несмотря на отсутствие различий по количеству Th2-клеток памяти между исследуемыми группами, мы обнаружили изменения по количеству аллерген-специфических Th2A-клеток. Согласно критерию Краскела–Уоллиса для множественных сравнений исследуемые группы достоверно отличались по содержанию Th2A-клеток (p = 0,0002). При последующем попарном сравнении тестом Манна–Уитни достоверное увеличение числа Th2A-клеток по сравнению с показателем условно здоровых доноров наблюдалось в группах пациентов с аллергическим ринитом, атопическим дерматитом и бронхиальной астмой (рис. 2). Кроме того, у пациентов с аллергическим ринитом и у пациентов с атопическим дерматитом уровень аллерген-специфических Th2A-клеток был значительно выше, чем у пациентов с бронхиальной астмой.

 

Рисунок 2. Содержание Th2A-клеток в норме, при аллергическом рините, атопическом дерматите и бронхиальной астме

Примечание. D – доноры, AR – аллергический ринит, AD – атопический дерматит, BA – бронхиальная астма. За 100% принято число CD4⁺CD45RO⁺CD27^- клеток. * – достоверное отличие от группы доноров, критерий Манна–Уитни (p < 0,01); # – достоверное отличие от группы пациентов с бронхиальной астмой, критерий Манна–Уитни (p < 0,01).

Figure 2. Content of Th2A-cells in norm, allergic rhinitis, atopic dermatitis and bronchial asthma

Note. D, healthy individuals; AR, patients with allergic rhinitis; AD, patients with atopic dermatits; BA, patients with bronhial asthma. The number of CD4⁺CD45RO⁺CD27^- cells was taken as 100%. The data are present as Median with the interquartile range (25^th-75^th percentiles). *, significant difference to donor’s group, Mann–Whitney test (p < 0.01); #, significant difference to group of patients with bronchial asthma, Mann–Whitney test (p < 0.01).

 

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что субпопуляция аллерген-специфических Th2A-клеток детектируется у пациентов с различными аллергическими заболеваниями, причем число клеток данной популяции повышено у людей с атопией по сравнению с показателем здоровых индивидуумов, у которых отсутствует аллергия в анамнезе. Что несомненно говорит об активном участии аллерген-специфических клеток в патогенезе аллергического ринита, атопического дерматита и бронхиальной астмы.

Интересно, что по нашим данным даже вне сезона поллинации у пациентов с аллергическим ринитом число аллерген-специфических клеток было повышено относительно показателя здоровых индивидуумов и пациентов с тяжелым течением бронхиальной астмы. В исследовании Wambre и соавт. было показано, что в период поллинации только на Th2A-клетках увеличивается экспрессия CD38, который связан с активацией аллерген-специфических CD4⁺ клеток [8], при этом Th2A-клетки детектировались у пациентов с пыльцевой аллергией в и вне сезона поллинации.

Ранее мы уже показали, что вне обострения у пациентов с аллергической бронхиальной астмой с частично-контролируемым течением также повышен уровень Th2A-клеток относительно здоровых индивидуумов [2]. В данном исследовании мы детектировали Th2A-клетки у пациентов с тяжелым течением заболевания и отсутствием контроля над заболеванием перед применением генно-инженерных биологических препаратов. Тем не менее число Th2A-клеток у данной группы пациентов было ниже, чем в группах пациентов с тяжелым атопическим дерматитом и аллергическим ринитом с неконтролируемым течением. Есть данные, что при бронхиальной астме Th2A-клетки снижаются после проведения аллергенспецифической иммунотерапии к аллергену клеща домашней пыли [7]. Интересно, что снижение аллерген-специфических клеток наблюдалось как в опытной группе, так и в группе плацебо, при этом число CD38-позитивных Th2A-клеток снижалось после АСИТ исключительно в опытной группе. Что открывает возможность применения CD38⁺ Th2A-клеток в качестве биомаркера эффективности терапии при аллергических заболеваниях.

Стоит отметить, что Th2A-клетки сохраняются в период ремиссии не только у пациентов с аллергических ринитом. Показано, что у пациентов с атопическим дерматитом Th2A-клетки детектируются в коже после года клинической ремиссии, связанной с применением дупилумаба [5], кроме того, эти клетки экспрессируют ряд рецепторов (IL17RB, ST2, CRLF2), позволяющих им реагировать на характерные для атопического дерматита эпидермальные алармины IL-25, IL-33, TSLP. Авторы предполагают, что Th2A-клетки, как клетки памяти, способны быстро развить патологический ответ и ответственны за развитие рецидива атопичесого дерматита после прекращения иммуносупрессивной терапии. Для повышения эффективности терапии аллергических заболеваний и достижения устойчивого терапевтического ответа необходимо исследовать подходы, которые бы воздействовали на Th2A-клетки, снижая их количество и функциональную активность.

Заключение

Таким образом, в нашем исследовании было показано, что популяция аллерген-специфических Th2A-клеток детектируется у пациентов с различными аллергичесими заболеваниями. Число Th2A-клеток в 3-4 раза увеличено у пациентов с аллергическим ринитом и атопическим дерматитом, и в 2 раза у пациентов с бронхиальной астмой относительно числа клеток у здоровых индивидуумов без аллергопатологии. Можно утверждать, что Th2A-клетки являются участниками аллергических реакций IgE-опосредованных заболеваний. Для достижения устойчивого терапевтического ответа необходимо разрабатывать подходы, которые бы воздействовали на Th2A-клетки, снижая их количество и функциональную активность. На сегодняшний день Th2A-клетки также можно рассматривать в качестве перспективного маркера для диагностики течения аллергического заболевания и оценки эффективности терапии.

About the authors

E. A. Blinova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Author for correspondence.
Email: blinovaelena-85@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Clinical Immunopathology

Russian Federation, Novosibirsk

M. I. Leonova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: blinovaelena-85@yandex.ru

Allergologist, Clinic of Immunopathology

Russian Federation, Novosibirsk

V. M. Nepomnyaschikh

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: blinovaelena-85@yandex.ru

Allergologist, Clinic of Immunopathology

Russian Federation, Novosibirsk

D. V. Demina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: blinovaelena-85@yandex.ru

PhD (Medicine), Head, Allergological Department, Clinic of Immunopathology

Russian Federation, Novosibirsk

References

Supplementary files