Response of cellular and humoral immune components of liver tissue in experimental physical load of different intensity

Full Text

Введение

Физическая активность занимает значимое место в жизни каждого человека и всего общества в целом. Это связано с тем, что здоровье всегда и во все времена было в приоритете. Однако высока вероятность развития внезапной смерти вследствие острых физических перенапряжений, которые возникают при чрезмерной нагрузке во время тренировки. В литературе описано множество случаев внезапной смерти: 15 июня 2024 г. черногорский футболист скоропостижно скончался. В конце августа 2024 г. защитник Кубка Либертадорес в «Сан-Пауле» (уругвайский футбол) внезапно потерял сознание на матче, впоследствии скончался в больнице. 15 декабря 2024 г. скоропостижно умер чемпион по пауэрлифтингу. 19 декабря 2024 г. в Волгограде внезапно скончался футболист. 20 декабря 2024 г. олимпийский чемпион в метании копья скоропостижно скончался. Неблагоприятный исход, возможно, может возникнуть в результате нарушения режима выполнения физической нагрузки либо при наличии скрытой патологии, для которой физические упражнения становятся триггерным фактором. В ранее проведенных исследованиях было выявлено, что тяжелая физическая нагрузка приводила к альтеративным изменениям в печени.

Печень является элементом иммунной системы, состоит из клеток врожденного и адаптивного иммунитета (популяции CD4⁺ и CD8⁺Т-клеток, В-лимфоциты) [1, 2, 3, 4, 5]. Дисрегуляция иммунных механизмов приводит к патологическому воспалению и нарушению тканевого гомеостаза органа, сопровождаемым прогрессирующим повреждением и развитием фиброза с формированием печеночной недостаточности [6, 7, 8, 9, 10, 11, 12]. Изучение изменений функционального состояния разных систем организма, органов и тканей, в том числе процессов, протекающих с участием иммунной системы, является важным разделом современных фундаментального и прикладного направлений медико-биологической области знаний. В связи с этим для понимания клеточных реакций, морфологических изменений, а также разработки терапевтических подходов необходимо знание о межклеточных взаимоотношениях. Цель исследования – описание гистологических изменений в печени и изучение доли CD8⁺, CD4⁺, CD79a и Fascin⁺ клеток при физической нагрузке разной интенсивности.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Исследование выполнено с соблюдением этических принципов проведения научных медицинских исследований с участием лабораторных животных в соответствии с ГОСТ №33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правилами содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами», ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики». План исследования одобрен локальным комитетом Марийского государственного университета (протокол № 1 от 28.04.2023).

Опыты проводились на самцах-крысах (n = 30) весом 240 г. Животные были разделены на три группы, которым давали физическую нагрузку разной интенсивности. 1-я группа крыс выполняла легкую физическую нагрузку, для чего их помещали в ванну с температурой воды 29-32 °С, в которой животные плавали 15 минут. Крысы 2-й группы проводили в ванне 30 минут; эту нагрузку расценивали как средней тяжести. Для воспроизведения тяжелой физической нагрузки (3-я группа) животные плавали в ванной до тех пор, пока они не начинали терять силы и тонуть. Обычно это наступало через 55-59 минут после нахождения животных в воде [7]. После извлечения из ванны животные были вялыми, некоторое время лежали, не принимали пищу. Животными всех серий было выполнено 10 сеансов водной нагрузки, после чего их выводили их эксперимента сразу после последнего сеанса (10 животных на группу). Контрольными животными были самцы крыс, весом – 240 г.

Животных умерщвляли путем декапитации на гильотине. После выведения животных из эксперимента для исследования атравматично забирали печень. Подготовку образцов ткани печени для гистологического исследования осуществляли на автоматическом процессоре Leica EG 1160 с последующей заливкой в парафин. Срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Для оценки реакции компонентов клеточного и гуморального звеньев иммунитета использовали иммуногистохимический метод трехэтапного непрямого иммуноферментного анализа (ИГХМ ТНИА) с использованием первичных моноклональных антител к антигенному маркеру к CD8⁺ (клон: SP16, 1/100, Thermo), CD4⁺ (SP35), CD79a (клон: SP18, 1/300, Thermo) и Fascin⁺ (клон: FCN01 Thermo) в готовом разведении. Визуализацию первичных антител, связавшихся с антигенами, проводили стандартным биотин-стрептавидин-пероксидазным методом с использованием набора LSAB-2 (Labeled Streptavidin Biotin System Peroxidase Dako, Дания). В качестве вторичных антител были использованы антивидовые анти-иммуноглобулиновые биотилированные антитела. В каждой серии иммуногистохимических реакций выполнялось контрольное исследование c инкубированием нескольких срезов в отсутствии первичных антител. Специфичность экспрессии искомого антигена в опытных срезах печени подтверждалась отсутствием ее в контрольных срезах, не обработанных первичными антителами. Микроскопическое исследование проводили на микроскопе Leica DM 2500 (Leica, Германия) с видеокамерой Leica DFC420, анализ изображений выполняли в программе Leica Application Suite (V4) (Leica, Германия). Количественный подсчет клеток производили в единице площади в 20 полях зрения при увеличении микроскопа ×1000.

Описательная статистическая обработка проводилась с использованием программы Statisticа 12 (США) и программы Microsoft Excel 2016 (США). Для проверки равенства медиан нескольких выборок рассчитывался критерий Краскела– Уоллиса, значимыми считались результаты при p < 0,05. Данные по экспрессии маркеров и количеству клеток по каждой группе животных усредняли и вычисляли стандартную ошибку и стандартное отклонение. Корреляционный анализ (использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмена) применялся для определения клеточных взаимодействий в следующих парах: CD4⁺/CD8⁺; CD4⁺/CD79а; CD4⁺/70 Fascin; CD8⁺/CD4⁺; CD8⁺/CD79а; CD8⁺/Fascin; CD79а/CD4⁺; CD79а/CD8⁺; CD79а/Fascin; Fascin/CD4⁺; Fascin/CD8⁺; Fascin/CD79а. Если значение коэффициента корреляции было меньше 0,5 – связь в паре была слабая и/или отсутствовала, 0,5-0,6 – связь умеренная, больше 0,7 – связь в паре сильная. Результаты считались достоверными при уровне значимости р < 0,05.

Результаты

При окраске гематоксилином и эозином в печени при легкой физической нагрузке в центролобулярных отделах гепатоциты выявлялись без изменений, а в периферических отделах долек обнаруживалась вакуольная дистрофия гепатоцитов, полнокровие сосудов. При средней физической активности гистоархитектоника ткани печени была сохранена, балочная структура прослеживалась, синусоиды были расширены, определялись единичные некробиотические изменения. При тяжелой физической активности появлялись очаговые некрозы гепатоцитов с перифокальной лимфо-лейкоцитарной инфильтрацией (рис. 1А, Б, В, см. 2-ю стр. обложки). Отмечалась выраженная диффузная вакуольная дистрофия гепатоцитов. Обнаруживались нарушения со стороны сосудов микроциркуляции в виде кровоизлияний, полнокровия и явлений капилляростаза.

Распределение CD4⁺ (Т-хелперы) и CD8⁺ (Т-киллеры) клеток в интактной печени выявляло следующую картину: доля CD4⁺ клеток была незначительна, располагались клетки около сосудов, в просветах синусоидов. Интенсивность свечения клеток достигала от 196,8 до 288,3. Наибольшая доля Т-лимфоцитов была представлена CD8⁺ клетками. При легкой физической нагрузке общий процент CD4⁺ (Т-хелперы) и CD8⁺ (Т-киллеры) клеток не изменился (табл. 1, 2). При средней физической активности процент CD4⁺ увеличился. Выявлялись участки, где CD4⁺ клетки (рис. 2, см. 2-ю стр. обложки) образовывали небольшие скопления, часто вокруг сосудов. Доля CD8⁺ клеток изменилась незначительно по сравнению с интактными животными (табл. 1, 2; рис. 3, см. 2-ю стр. обложки). При тяжелой физической нагрузке снизилась доля CD4⁺ клеток в паренхиме и около сосудов, следовательно общий процент клеток уменьшился в 1,6 раза (р = 0,002) в сравнении с интактной группой (табл. 1; рис. 2, см. 2-ю стр. обложки).

Таблица 1. Показатели CD4⁺ клеток при физической нагрузке разной интенсивности

Table 1. CD4⁺ cell counts during physical activity of different intensities

Примечание. * – уровень статистической значимости различий 3-й группы с интактной.

Note. *, level of statistical significance of differences between the 3^rd group and the intact.

Таблица 2. Показатели CD8⁺ клеток при физической нагрузке разной интенсивности

Table 2. CD8⁺ cell counts during physical activity of different intensities

Примечание. * – уровень статистической значимости различий 2-й группы с интактной; ** – уровень статистической значимости различий 3-й группы с интактной.

Note. *, level of statistical significance of differences between the 2^nd group and the intact one; **, level of statistical significance of differences between the 3^rd group and the intact one.

Выявлялось достоверно более высокое содержание CD8⁺ лимфоцитов в паренхиме печени и периваскулярно, вероятно, обусловленное более выраженными гистологическими изменениями в печени. Полученные данные схожи с исследованиями ученых, которые выявили, что интенсивные физические нагрузки могут мобилизовать несколько субпопуляций лейкоцитов. Доля CD8⁺Т-клеток в общем количестве Т-клеток увеличивалась, а доля CD4⁺Т-клеток в общем количестве Т-клеток уменьшалась сразу после тренировки, и показатели возвращались к исходному уровню через 30 минут после тренировки [13]. Исследование I. Crispe [5] объясняет изменения в популяции CD4⁺ и CD8⁺ клеток следующими данными: такой механизм активации Т-клеток сопровождается праймированием CD8⁺, но не CD4⁺ клеток; дефицит CD4⁺T-клеток в этих условиях «преодолевается» посредством увеличения числа CD8⁺Т-клеток, которые в последующем функционируют автономно. Вероятно, что уровень Т-киллеров CD8⁺ повышается в результате внутриклеточных воспалительных процессов. При тяжелой физической нагрузке процент CD8⁺ клеток увеличился (рис. 3, см. 2-ю стр. обложки) в 2,8 раза периваскулярно и около сосудов, следовательно, общий процент клеток возрос в 2,4 раза (р = 0,002) при сравнении с интактными животными (табл. 2).

Белок CD79a присутствует на поверхности только B-клеток, что делает его надежным маркером B-лимфоцитов. В-лимфоциты – важнейший компонент иммунной системы, участвуют в различных межклеточных взаимодействиях, вносят основной вклад в элиминацию чужеродных антигенов из организма [14, 15]. CD79а⁺ клетки встречались в строме портальных трактов. Доля описываемых клеток была невелика и составляла у интактных – 3,8±0,02, при легкой физической нагрузке – 3,9±0,04, при умеренной – 4,2±0,04. Полученные данные схожи с данными других исследователей, которые определяли долю В-клеток, гранулоцитов и моноцитов при выполнении интенсивной физической нагрузки, при этом показатели не изменялись. У животных, выполняющих тяжелую физическую нагрузку, отмечалось увеличение доли CD79a⁺ клеток до 9,5±0,06% (рис. 4, см. 3-ю стр. обложки). Происходило возрастание доли позитивных CD79a клеток в 2,5 раза в сравнении с интактной группой (р = 0,002).

Fascin – это белок, определяемый в зрелых дендритных клетках (ДК). ДК мигрируют в печень из лимфатической или кровеносной системы. После попадания в печень ДК притягиваются CCL3 на клетках Купфера и выходят из эндотелиальных пор синусоидов [15, 16, 17, 18] печени в пространство Диссе [15]. Затем ДК мигрируют в область воротной вены через систему CCR7-CCL21 и взаимодействуют с Т-клетками, образуя лимфоидную ткань, ассоциированную с портальным трактом [16]. Вероятно, в связи с описываемыми особенностями ДК при легкой физической нагрузке, так же как у интактных животных, определялись около сосудов: центральных вен, портальных трактов и лишь в небольшом числе в паренхиме печени (рис. 5; рис. 6, см. 3-ю стр. обложки). Известно, что ДК бывают в незрелом и зрелом состоянии [9]. Незрелые ДК не способны представлять антигены и стимулировать Т-лимфоциты [19, 20]. Зрелые ДК перестают захватывать новые антигены, но способны представлять ранее поглощенный антигенный материал и индуцировать клеточный ответ [19]. При средней и тяжелой физической нагрузке в основном Fascin⁺ клетки встречались около или вдоль сосудов. Отмечалось повышение позитивных клеток по сравнению с интактными животными (рис. 6, см. 3-ю стр. обложки).

Рисунок 5. Процент Fascin⁺ клеток после физической нагрузки разной интенсивности

Примечание. ИГ – интактная группа; * – уровень статистической значимости различий 3-й группы с ИГ (р = 0,04).

Figure 5. Percentage of Fascin⁺ cells after physical activity of varying intensity

Note. IG, intact group; *, level of statistical significance of differences in the 3^rd group with IG (p = 0.04).

При изучении корреляционных взаимодействий при средней физической нагрузке связь между CD4⁺/CD8⁺ была сильной (r = 0,8; р < 0,05). При тяжелой физической нагрузке сильные корреляционные взаимодействия выявлялись между CD8⁺/CD4⁺ (r = -0,8; р < 0,05). Также определялась умеренная связь между CD79а/Fascin (r = 0,7; р < 0,05) при средней и тяжелой физических нагрузках. Выявлена сильная положительная связь между Fascin/CD79 (r = -0,8; р < 0,05) (табл. 3) при тяжелой физической нагрузке.

Таблица 3. Корреляционные взаимодействия между иммунными клетками в печени при физической нагрузке (коэффициент ранговой корреляции Спирмена)

Table 3. Correlation interactions between immune cells in the liver during physical exercise (Spearman’s rank correlation coefficient)

Примечание. Коэффициент корреляции < 0,5 – связь в паре слабая или отсутствует; 0,5-0,7 – связь умеренная; > 0,7 – связь в паре сильная.

Note. Correlation coefficient < 0.5, weak or absent connection in the pair; 0.5-0.7 – moderate connection; > 0.7, strong connection in the pair.

Обсуждение

Известно, что Т-хелперы (Th-клетки) имеют на поверхности клетки молекулы CD4. CD4⁺Т-клетки выполняют функции регулирования процессов работы других клеток иммунной системы (Т-киллеров, B-лимфоцитов, макрофагов, NK-клеток), распознают антигены и запускают или останавливают процессы функционирования механизмов приобретенного клеточного иммунного ответа. Т-хелперы оказывают стимулирующее влияние на В-лимфоциты, работу моноцитов, тучных клеток и предшественников Т-киллеров к «включению» в иммунную реакцию, участвуют в клеточно-опосредованном иммунитете. В-клетки сначала активируются Т-клетками, а затем начинают размножаться и создавать копии В-клеток памяти и плазматических клеток, которые мигрируют в очаг повреждения [9, 10]. ДК выполняют важнейшую роль в функционировании иммунной системы, так как они необходимы для активации T-клеточного ответа. ДК в печени представляют собой разнообразную популяцию клеток, связанных с врожденным и адаптивным иммунитетом и являются модуляторами иммунной системы печени [9, 19, 20]. В описываемом исследовании выявлено, что ДК располагались в перипортальной области, вероятно, это обычные ДК печени, которые поддерживают иммунный гомеостаз, одновременно реагируя на локальные повреждения, а также инициируя врожденный и адаптивный иммунитет [19].

Результаты исследования устанавливают, что при умеренной физической нагрузке отмечалась реакция со стороны Т-хелперов, лежащая в основе клеточно-опосредованного иммунного ответа. При тяжелой физической активности возникало цитотоксически-опосредованное повреждение паренхимы печени в виде возрастания доли CD8⁺ лимфоцитов в печени, вероятно, связанное с выраженной воспалительной реакцией в ней. По данным некоторых авторов [2], в период интенсивных тренировок в крови уменьшался общий уровень Т-клеток (CD3⁺), лимфоцитов хелперов при сохранении доли супрессоров. Авторы установили, что уменьшение в крови популяции CD3⁺, CD4⁺ клеток, свидетельствовало о нарушении уровня клеточной иммунной защиты. В другом исследовании авторы выявили, что при физической нагрузке в ходе субхронического эксперимента возрастал уровень нейтрофилов и эозинофилов, что согласовалось с данными о том, что физические упражнения сопряжены с воспалением и выработкой интерлейкинов, а также увеличением циркулирующих нейтрофилов и эозинофилов [3].

При изучении корреляционных взаимодействий при средней физической нагрузке связь между CD4⁺/CD8⁺ была сильной (r = 0,8; р < 0,05). При тяжелой физической нагрузке сильные корреляционные взаимодействия выявлялись между CD8⁺/CD4⁺ (r = -0,8; р < 0,05). Также определялась умеренная связь между CD79а/Fascin (r = 0,7; р < 0,05) при средней и тяжелой физических нагрузках. Выявлена сильная положительная связь между Fascin/CD79 (r = -0,8; р < 0,05) (табл. 3) при тяжелой физической нагрузке. Следовательно, при умеренной физической нагрузке отмечалась реакция со стороны Т-хелперов, лежащая в основе клеточно-опосредованного иммунного ответа; при тяжелой нагрузке выявлялась реакция со стороны Т-киллеров, а также подключалось гуморальное звено иммунной системы. Fascin⁺ клетки являются дендритными, которые выполняют важнейшую роль в функционировании иммунной системы, поскольку они необходимы для активации T-клеточного ответа. ДК экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости I (MHC-I) и II (MHC-II), на которых представляют фрагменты антигенов T-клеткам. Одновременно В-клетки влияют на регуляцию врожденного и адаптивного иммунитета, вырабатывая цитокины.

Заключение

Таким образом, повреждение печени при тяжелой физической нагрузке ассоциировано с реакцией компонентов клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Гистологически отмечались альтеративные изменения и воспалительная реакция в печеночной ткани.

ИЛЛЮСТРАЦИИ К СТАТЬЕ «РЕАКЦИЯ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО ЗВЕНЬЕВ ИММУНИТЕТА В ПЕЧЕНИ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ РАЗНОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ» (АВТОР: АЛЬПИДОВСКАЯ О.В. [С. 263-270])

ILLUSTRATIONS FOR THE ARTICLE "RESPONSE OF CELLULAR AND HUMORAL IMMUNE COMPONENTS OF LIVER TISSUE IN EXPERIMENTAL PHYSICAL LOAD OF DIFFERENT INTENSITY" (AUTHOR: ALPIDOVSKAYA O.V. [PP. 263-270])

Рисунок 1. Микроскопическая картина: А – печень интактных животных; Б – третья группа: некробиоз и кариорексис отдельных клеток; В – клеточная инфильтрация

Примечание. Окраска гематоксилином и эозином, ×400.

Figure 1. Microscopic picture: A, liver of intact animals; B, Third group: necrobiosis and karyorrhexis of individual cells; С, cellular infiltration

Note. Hematoxylin and eosin staining, ×400.

Рисунок 2. Распределение СD4⁺ клеток в печени: А – у интактных животных; Б – при средней физической нагрузке (в сосудах); В – при тяжелой физической нагрузке (небольшое число клеток вокруг сосудов и в паренхиме печени)

Примечание. Иммуногистохимическая реакция на СD4⁺, ×400.

Figure 2. Distribution of CD4⁺ cells in the liver: A, in intact animals; B, under moderate physical exertion (in vessels); C, under severe physical exertion (a small number of cells around vessels and in the liver parenchyma)

Note. Immunohistochemical reaction to CD4⁺, ×400.

Рисунок 3. СD8⁺ клетки в печени: А – у интактных животных; Б – при средней физической нагрузке (в синусоидах); В – при тяжелой физической нагрузке (скопление клеток вокруг сосудов и в паренхиме печени)

Примечание. Иммуногистохимическая реакция на СD8⁺, ×400.

Figure 3. CD8⁺ cells in the liver: A, in intact animals; B, under moderate physical exertion (in sinusoids); C, under severe physical exertion (cell accumulation around vessels and in the liver parenchyma)

Note. Immunohistochemical reaction to CD8⁺, ×400.

Рисунок 4. CD79a⁺ клетки в печени: А – у интактных животных; Б – при средней физической нагрузке (в расширенных синусоидах); В – при тяжелой физической нагрузке (скопление клеток в сосудах)

Примечание. Иммуногистохимическая реакция на CD79a⁺, ×400.

Figure 4. CD79a⁺ cells in the liver: A, in intact animals; B, under moderate physical exertion (in dilated sinusoids); C, under severe physical exertion (cell accumulation in vessels)

Note. Immunohistochemical reaction for CD79a⁺, ×400.

Рисунок 6. Распределение Fascin⁺ клеток в печени: А – у интактных животных; Б – при средней физической нагрузке (в расширенных синусоидах); В – при тяжелой физической нагрузке

Примечание. Иммуногистохимическая реакция на Fascin⁺, ×400.

Figure 6. Distribution of Fascin⁺ cells in the liver: A, in intact animals; B, under moderate physical exertion (in dilated sinusoids); C, under severe physical exertion

Note. Immunohistochemical reaction to Fascin⁺, ×400.

About the authors

Olga V. Alpidovskaya

Author for correspondence.
Email: olavorobeva@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of General and Clinical Morphology and Forensic Medicine

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure 1. Microscopic picture: A, liver of intact animals; B, Third group: necrobiosis and karyorrhexis of individual cells; С, cellular infiltration

Download (851KB)

Indexing metadata

3. Figure 2. Distribution of CD4+ cells in the liver: A, in intact animals; B, under moderate physical exertion (in vessels); C, under severe physical exertion (a small number of cells around vessels and in the liver parenchyma)

Download (679KB)

Indexing metadata

4. Figure 3. CD8+ cells in the liver: A, in intact animals; B, under moderate physical exertion (in sinusoids); C, under severe physical exertion (cell accumulation around vessels and in the liver parenchyma)

Download (630KB)

Indexing metadata

5. Figure 4. CD79a+ cells in the liver: A, in intact animals; B, under moderate physical exertion (in dilated sinusoids); C, under severe physical exertion (cell accumulation in vessels)

Download (697KB)

Indexing metadata

6. Figure 5. Percentage of Fascin+ cells after physical activity of varying intensity

Download (93KB)

Indexing metadata

7. Figure 6. Distribution of Fascin+ cells in the liver: A, in intact animals; B, under moderate physical exertion (in dilated sinusoids); C, under severe physical exertion

Download (725KB)

Indexing metadata