Expression of Toll-like receptor genes in rat spleen and hypothalamus under conditions of stress exposure and administration of rat defensin RatNP-3

Full Text

Введение

Toll-подобные рецепторы (TLR) относятся к категории рецепторов распознавания образов (PRR) системы защиты хозяина. PRR распознают специфические молекулярные паттерны у микробов, известные как патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), а также молекулы, высвобождаемые поврежденной клеткой хозяина, которые известны как молекулярные паттерны, связанные с повреждением (DAMP) [12]. Таким образом, PRR участвуют в развитии иммунного ответа против патогенов и помогают в процессе самовосстановления клетки.

Распознавание Toll-подобных рецепторов активирует сигнальный каскад, который продуцирует секретируемые цитокины и хемокины, которые затем активируют как врожденный, так и адаптивный иммунный ответ [10]. TLR присутствуют как на иммунных клетках, включая моноциты, макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы, B-клетки, Т-клетки, тучные клетки, естественные клетки-киллеры, так и на неиммунных клетках, включая фибробласты, эпителиальные клетки, астроциты, кератиноциты и тромбоциты [3, 4, 7]. TLR также представлены на различных опухолевых клетках, и их активация может индуцировать или уменьшать рост опухоли [6].

На сегодняшний день идентифицировано 13 членов семейства TLR, наиболее изучены из которых TLR2, TLR3 и TLR4. Рецепторы TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 и TLR10 расположены на поверхности клетки, а TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, TLR11, и TLR13 – на мембранах внутриклеточных компартментов [9]. TLR взаимодействует с лигандом при участии корецепторных молекул (MD-2, CD14), что в дальнейшем приводит к инициации сигнального пути трансдукции, завершающейся продукцией провоспалительных молекулярных факторов (цитокинов, хемокинов и др.), интерферонов β/α или активацией регуляторных сигналов адаптивного иммунитета [5, 9].

Как уже было сказано, лигандами для Toll-подобных рецепторов могут служить эндогенные молекулы, связанные с повреждением клеток (DAMP или алармины). Можно предположить, что среди эндогенных соединений, концентрация которых увеличивается при неблагоприятных условиях, могут быть и антагонисты TLR, которые препятствуют излишней экспрессии этих рецепторов.

Одной из самых распространенных причин, вызывающих изменения иммунного ответа, являются стрессирующие воздействия, которые приводят к перераспределительным реакциям лейкоцитов крови, изменению гормонального уровня и продукции цитокинов. Еще одним хорошо известным явлением при воздействии стресса является увеличение количества нейтрофилов. Хотя это явление широко известно и является стандартным проявлением реакции организма на стресс, его биологический смысл до конца не ясен. Можно предположить, что антимикробные пептиды и белки, которые высвобождаются из нейтрофилов во внеклеточное пространство в процессе стресс-стимулированной дегрануляции, такие как пептиды дефенсины, могут не только проявлять антибиотическое действие, но и влиять на развитие стресс-реакции по принципу обратной связи. Так, показано, что предварительное введение дефенсина крысы снижает стресс-индуцированное повышение уровня кортикостерона в крови и оказывает нормализующее действие на изменение клеточного состава крови у крыс [1].

Представляется возможным, что система TLR может играть важную роль в процессе активации врожденного иммунитета в ответ на стресс, и эндогенные антибиотические пептиды также участвуют в регуляции этого процесса.

Целью исследования было определить, как введение эндогенного антимикробного пептида дефенсина RatNP-3 влияет на экспрессию генов TLR3 и TLR4 в гипоталамусе и селезенке крыс после острого эмоционально-физического стресса.

Материалы и методы

Работа была выполнена на взрослых крысах-самцах массой 290-310 г породы Wistar. Крыс содержали согласно стандартам обращения с лабораторными животными.

Выделение дефенсина RNP-3 из лейкоцитов крысы проводили по схеме, применяемой для выделения антимикробных пептидов, включающей экстракцию пептидов в кислой среде, их разделение методами ультрафильтрации, препаративного электрофореза и обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Получен высокоочищенный препарат RNP- 3, чистоту и соответствие молекулярной массе подтверждали с помощью масс-спектрометрии MALDI TOF.

В качестве модели стресса использовали принудительное плавание в холодной воде. Одну группу животных помещали в бассейн, заполненный водой температурой 0-4 °С, на 2 мин, другой группе перед плаванием вводили внутрибрюшинно дефенсин RatNP-3 в дозе 100 мкг/кг веса. В качестве контрольной группы животных были взяты крысы, не подвергавшиеся никаким воздействиям. В каждой группе было по 5-6 животных. Через 3 часа после плавания животных декапитировали и извлекали гипоталамус и селезенку.

Ткани гомогенизировали с помощью гомогенизатора Precellys Evolution, из полученного гомогенизата выделяли РНК (Gene Elute Mammalian total RNA mini prepаration kit, Sigma-Aldrich, США), после чего с помощью метода обратной транскрипции синтезировали комплементарную ДНК (кДНК) (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, США), затем методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (амплификатор CFX 96, Bio-Rad, США) определяли относительную степень экспрессии генов TLR3, TLR4 с помощью готовой смеси реактивов «БиоМастер» Hs-qPCR (2x). Уровень экспрессии генов оценивали относительно экспрессии гена домашнего хозяйства глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH).

Синтез праймеров осуществляла фирма Beagle (Санкт-Петербург):

TLR3 – прямая последовательность 5’-CGGTCAAGGTGTTCAAGA-3’;

TLR3 – обратная последовательность 5’-GGATGGTAGAAGCGTGTT-3’;

TLR4 – прямая последовательность 5’-CCTGAAGATCTTAAGAAGCTAT-3’;

TLR4 – обратная последовательность 5’-CCTTGTCTTCAATTGTCTCAAT-3’;

GAPDH – прямая последовательность 5’-CCTGCACCACCAACTGCTTAGC-3’;

GAPDH – обратная последовательность 5’-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3’.

Специфичность продуктов амплификации контролировали по кривым плавления.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ Statistica 10.0 по U-критерию Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

Установлено, что экспрессия генов TLR3 и TLR4 повышается через 3 часа после стрессирующего воздействия, как в гипоталамусе, так и в селезенке, но превентивное введение дефенсина снижало уровень экспрессии этих генов только в спленоцитах (табл. 1) и не влияло на экспрессию в гипоталамусе (табл. 2).

 

Таблица 1. Экспрессия генов TLR3 и TLR4 относительно экспрессии гена GAPDH в селезенке крыс при плавательном стрессе и введении дефенсина RatNP-3 (n = 5-6; Me (Q_0,25-Q_0,75))

Table 1. TLR3 and TLR4 gene expression relative to GAPDH gene expression in rat spleen under swimming stress and administration of defensin RatNP-3 (n = 5-6; Me (Q_0.25-Q_0.75))

№ No	Группы животных Groups of animals	Относительная экспрессия генов Relative gene expression
		TLR3	TLR4
1	Интактные Intact	0,003826 (0,000868-0,008912)	0,002590 (0,002400-0,003450)
2	После стресса After stress	0,135842* (0,069348-0,151774)	0,012580* (0,005505-0,022955)
3	После стресса и введения дефенсина After stress and defensin administration	0,005384# (0,001748-0,007340)	0,002565# (0,001540-0,003150)

Примечание.* – p < 0,05 относительно группы 1 (по U-критерию Манна–Уитни), ^# – p < 0,05 относительно группы 2 (по U-критерию Манна–Уитни).

Note. *, p < 0.05 vs group 1 according to the nonparametric Mann–Whitney U test; ^#, p < 0.05 vs group 2 according to the nonparametric Mann–Whitney U test.

 

Таблица 2. Экспрессия генов TLR3 и TLR4 относительно экспрессии гена GAPDH в гипоталамусе крыс при плавательном стрессе и введении дефенсина RatNP-3 (n = 5-6; Me (Q_0,25-Q_0,75))

Table 2. TLR3 and TLR4 gene expression relative to GAPDH gene expression in rat hypothalamus under swimming stress and administration of defensin RatNP-3 (n = 5-6; Me (Q_0.25-Q_0.75))

№ No	Группы животных Groups of animals	Относительная экспрессия генов Relative gene expression
		TLR3	TLR4
1	Интактные Intact	0,001194 (0,001004-0,001818)	0,000502 (0,000259-0,000758)
2	После стресса After stress	0,003562* (0,002323-0,004334)	0,005715* (0,004373-0,018426)
3	После стресса и введения дефенсина After stress and defensin administration	0,010525* (0,003217-0,017701)	0,011078* (0,006867-0,019288)

Примечание.* – p < 0,05 относительно группы 1 (по U-критерию Манна–Уитни).

Note. *, p < 0.05 vs group 1 according to the nonparametric Mann–Whitney U test.

 

Как известно, стресс вызывает значительные изменения в различных системах организма, включая многочисленные перераспределительные реакции в иммунной системе как на клеточном уровне, так и на уровне гуморальных факторов. Однако степень выраженности стресс-опосредованных изменений в иммунной системе и их направленность могут варьироваться в зависимости от типа стрессора и продолжительности его воздействия.

В нашем исследовании мы использовали хорошо изученную модель острого эмоционально-физического стресса, которая заключалась в том, что экспериментальные животные плавали в холодной воде в течение двух минут. Для этой модели характерны классические стресс-индуцированные реакции организма, такие как повышение уровня гормона стресса кортикостерона через 30 минут после воздействия, увеличение количества нейтрофилов и другие [1].

Ранее мы уже получили данные о том, что после воздействия такого стресса через 3 часа в гипоталамусе повышается экспрессия генов TLR3 и TLR4 [2]. Рецептор TLR3 расположен на поверхности эндосом и преимущественно распознает двухцепочечную РНК. Активация TLR3 запускает противовирусный ответ, стимулируя синтез интерферонов I типа. Однако существуют данные о том, что этот тип рецепторов также участвует в патогенезе бактериальной пневмонии и системного гипервоспаления при сепсисе [11].

Ген TLR4 кодирует Toll-подобный рецептор 4, который является наиболее изученным членом семейства PRR. Он экспрессируется на поверхности большинства клеток млекопитающих и распознает широкий спектр бактериальных PAMP. Также для него описаны эндогенные лиганды. Активация этого рецептора приводит к синтезу провоспалительных цитокинов [8].

Выводы

Таким образом, получены данные, указывающие на системную активацию Toll-подобных рецепторов в гипоталамических структурах мозга и селезенке в ответ на острый стресс. Поскольку пути сигналинга, активируемые TLR, приводят к синтезу преимущественно провоспалительных факторов, активация целого комплекса TLR также может служить сигналом для развития системного воспаления при стрессе.

Тот факт, что введение эндогенных дефенсинов не влияет на экспрессию генов TLR в гипоталамусе, свидетельствует о том, что регуляторное действие дефенсинов нейтрофильных гранулоцитов не опосредуется через центральные механизмы регуляции.

About the authors

Galina M. Aleshina

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: aleshina.gm@iemspb.ru

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Laboratory of General Pathology

Russian Federation, St. Petersburg

T. A. Filatenkova

Institute of Experimental Medicine

Email: aleshina.gm@iemspb.ru

Research Associate, Laboratory of General Pathology

Russian Federation, St. Petersburg

M. V. Shustov

St. Petersburg State Chemical Pharmaceutical University

Email: aleshina.gm@iemspb.ru

Laboratory Assistant, Scientific and Educational Center

Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files