Immunomorphometric indices in rats after administration of polyoxometalates

Full Text

Введение

Исследование действия наночастиц на органы иммунной системы необходимо для прогнозирования иммунорезистентности и воспалительной реакции организма. Влияние наночастиц на структуру и функции органов иммунной системы зависит от химической природы наночастиц, их размера, растворимости, способа и длительности экспозиции, что может быть причиной противоречивости результатов исследований, представленных в различных публикациях [2, 4, 5, 6, 7]. В ряде экспериментов показано, что введение наночастиц с оксидами меди и алюминия, сопровождается накоплением металлов в органах, подавлением пролиферации и апоптозом иммунокомпетентных клеток в тимусе, селезенке, лимфоузлах и в крови [2, 4]. В других исследованиях при введении наноматериалов, содержащих золото, оксиды железа, кадмия, выявлены усиление пролиферации и дифференцировки лимфоцитов в селезенке и тимусе, увеличение количества лейкоцитов и нейтрофилов в крови [5, 6, 7], что авторы расценивают как провоспалительное действие наночастиц.

Нанокластерный полиоксометаллат {Mo₇₂Fe₃₀} (ПОМ) – соединение, молекулы которого представляют собой наноразмерную сферическую структуру, образованную кислородными полиэдрами молибдена и железа, и стабилизирующими лигандами. Химическая формула ПОМ: [Mo₇₂Fe₃₀O₂₅₂(CH₃COO)₁₂{Mo₂O₇(H₂O)}₂{H₂Mo₂O₈(H2O)} (H₂O)₉₁] ∙ 150H₂O. ПОМ не проявляет выраженной токсичности, не накапливаются в печени, почках, головном мозге, но влияние ПОМ на органы иммунной системы исследовано недостаточно [3]. Действие соединений, организованных в наночастицы, может отличаться от действия смеси отдельных компонентов ПОМ.

Цель работы – исследовать влияние ПОМ и смеси компонентов ПОМ (дериватов) на морфометрические показатели тимуса, селезенки, количество лейкоцитов крови и их предшественников в костном мозге.

Материалы и методы

ПОМ изготовили в соответствии с методом Müller et al. (1998), описанном в публикации [3]. Для инъекций использовали водный раствор ПОМ 1 мг/мл. Дериваты ПОМ получали посредством увеличения pH с последующей нейтрализацией раствора; конечная концентрация дериватов составляла 1 мг/мл. В эксперименте использовано 25 крыс-самцов Wistar возрастом 3 месяца и массой 250-350 г. Обращение с животными соответствовало Директиве Совета ЕС 2010/63/EU и Протоколу этического комитета ИИФ УрО РАН (№ D-PM-2015-27). Выделили группы животных по 5 крыс в группе: 1 – интактная; 2 – ПОМ 1 сутки; 3 – ПОМ 7 суток; 4 – дериваты 1 сутки; 5 – дериваты 7 суток. Раствор ПОМ или дериватов вводили внутримышечно однократно или семикратно из расчета 0,15 мг/100 г массы тела в однократной дозе. Животных выводили из эксперимента декапитацией под эфирным наркозом. Гематологические показатели определяли в крови из хвостовой вены на анализаторе Cеlly 70 Biocode Hycel. Мазок костного мозга из бедренной кости фиксировали по Май–Грюнвальду, окрашивали по Романовскому–Гимзе. Для фиксации тимуса и селезенки использовали 10% формалин, обезвоживание в батарее спиртов и заливку в парафин, для изготовления срезов – микротом Leica SM 2000R (Leica Microsystems, Германия), окрашивание гематоксилином и эозином. Подсчет морфометрических показателей проводили при увеличении в 40 и 100 раз с использованием светового микроскопа Leica DM2500, камеры Leica DFC420 и программного пакета анализа изображений Leica Application Suite (Leica Microsystems, Германия). Определяли площадь коркового и мозгового вещества тимуса и рассчитывали корково-мозговой индекс (КМИ). В селезенке подсчитывали площадь стромы (СТ), белой пульпы (БП) и лимфоидных фолликулов (ЛФ), ширину периартериальных лимфоидных муфт (ПАЛМ), площадь мантийной и маргинальной зон ЛФ. Рассчитывали стромально-паренхиматозное отношение (СПО), фолликулярный коэффициент (ФК) и лимфоидный коэффициент (ЛК) по формулам: СПО = (СТ / БП) × 100, ФК = (БП × ЛФ) / 1000000000, где делитель взят произвольно с целью получения удобных для восприятия числовых значений, ЛК = ЛФ / ПАЛМ [1]. Данные представлены в виде среднее ± ошибка среднего. Для выявления достоверных отличий между группами использовали U-критерий Мана–Уитни, отличия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

При сравнении КМИ тимуса крыс, получавших ПОМ и дериваты наночастиц, не обнаружено достоверных отличий от КМИ интактных крыс (табл. 1), что указывает на отсутствие Т-клеточной активации.

 

Таблица 1. Морфометрические показатели тимуса и селезенки

Table 1. Morphometric parameters of the thymus and spleen

Группы/Показатели Groups/Parameters	1 Интактная Intact	2 ПОМ 1 сутки POMs 1 day	3 ПОМ 7 суток POMs 7 days	4 Дериваты 1 сутки Derivatives 1 day	5 Дериваты 7 суток Derivatives 7 days
КМИ TCI	5,24 ± 0,66	3,93 ± 0,53	7,50 ± 1,94	3,81 ± 0,80	6,38 ± 1,25
БП, мм2 WP, mm2	1,012 ± 0,058	0,900 ± 0,129	1,091 ± 0,177	0,774 ± 0,131	2,188 ± 0,131* **
СПО SPR	539,7 ± 33,0	640,4 ± 97,8	393,4 ± 43,1*	669,4 ± 95,8	226,0 ± 8,1* **
ФК FC	85,00 ± 22,99	83,03 ± 17,80	157,55 ± 49,24	60,95 ± 15,68	364,57 ± 26,50* **
ЛК LC	1652,5 ± 295,5	1696,2 ± 204,2	2712,6 ± 379,0	1083,6 ± 184,5	1787,6 ± 120,5
Мантийная зона ЛФ, µм × 103 Mantle zone of LF, µm × 103	44,42 ± 2,62	35,63 ± 6,12	64,20 ± 14,43	41,47 ± 5,83	50,43 ± 7,02
Маргинальная зона ЛФ, µм × 103 Marginal zone of LF, µm × 103	42,08 ± 25,80	59,81 ± 18,85	71,37 ± 23,77	37,64 ± 13,21	111,34 ± 4,25*

Примечание. КМИ – корково-мозговой индекс тимуса. Показатели в селезенке: БП – площадь белой пульпы; СПО – стромально-паренхиматозное отношение; ФК – фолликулярный коэффициент; ЛК – лимфоидный коэффициент; ЛФ – лимфоидный фолликул. ПОМ – полиоксометаллаты. * – p < 0,05 по сравнению с интактной группой; ** – p < 0,05 по сравнению с группой «дериваты» соответствующего срока.

Note. TCI, thymus cortex index. Splenic parameters: WP, white pulp area; SPR, stromal-parenchymatous ratio; FC, follicular coefficient; LC – lymphoid coefficient; LF, lymphoid follicle. POMs, polyoxometalates. *, p < 0.05 compared to the intact group; **, p < 0.05 compared to the derivative group of the corresponding period.

 

При подсчете морфометрических показателей селезенки у крыс, получивших 7 инъекций ПОМ (группа 3), установлено только снижение коэффициента СПО относительно нормы (табл. 1). Семикратное введение дериватов (группа 5) сопровождалось увеличением площади белой пульпы и, соответственно, снижением СПО, более выраженным, чем у животных группы 3. Уменьшение коэффициента СПО связано с гиперплазией белой пульпы, подвергающейся действию ПОМ и их дериватов. Более интенсивное действие дериватов по сравнению с действием ПОМ подтверждается увеличением ФК в группе 5 относительно показателя интактных крыс и крыс группы 3, поскольку ФК отражает общий объем лимфатического аппарата селезенки [1]. У крыс, получавших ПОМ и дериваты, не обнаружено достоверных отличий от нормы показателя ЛК, соответствующего соотношению зон В-лимфоцитов и Т-лимфоцитов, а также изменения ширины мантийной зоны, где происходит кооперация Т- и В-лимфоцитов и накопление В-лимфоцитов памяти. В то же время при семикратном действии дериватов увеличилась относительно нормы ширина маргинальной зоны – область взаимодействия Т- и В-лимфоцитов и презентации антигенов макрофагами [1].

Изменения гематологических показателей после действия ПОМ и дериватов проявляются в виде дефицита общего количества лейкоцитов, особенно выраженного при семикратном действии дериватов (табл. 2). Недостаток лейкоцитов после введения ПОМ происходит за счет уменьшения фракции гранулоцитов, а после введения дериватов – за счет уменьшения лимфоцитарной и гранулоцитарной фракций. Дефицит гранулоцитов, вероятно, связан с активацией нетоза в ответ на введение чужеродного материала. Дериваты, помимо нетоза, могут, вероятно, также вызывать апоптоз лимфоцитов [3]. Гиперплазия лимфоидного аппарата селезенки, особенно выраженная в группе 5, может быть компенсаторным ответом на уменьшение количества лимфоцитов в крови после введения дериватов.

 

Таблица 2. Лейкоциты в крови (тыс/мкл) и предшественники лейкоцитов в костном мозге (миллион клеток/100 г массы тела)

Table 2. Leukocytes in the blood (thousand/µL) and leukocyte precursors in the bone marrow (million cells/100 g body weight)

Группы/Показатели Groups/Parameters	1 Интактная Intact	2 ПОМ 1 сутки POMs 1 day	3 ПОМ 7 суток POMs 7 days	4 Дериваты 1 сутки Derivatives 1 day	5 Дериваты 7 суток Derivatives 7 days
Лейкоциты в крови Leukocytes in the blood	10,65 ± 0,80	6,21 ± 0,53*	6,23 ± 0,81*	4,70 ± 0,42*	3,34 ± 0,78* **
Лимфоциты в крови Lymphocytes in the blood	4,10 ± 0,25	4,50 ± 0,40	4,22 ± 0,47	2,47 ± 0,34* **	1,92 ± 0,53* **
Моноциты в крови Monocytes in the blood	0,51 ± 0,17	0,58 ± 0,07	0,56 ± 0,11	0,38 ± 0,24	0,13 ± 0,07
Гранулоциты в крови Granulocytes in blood	6,00 ± 0,70	1,08 ± 0,08*	1,48 ± 0,40*	1,83 ± 0,37*	1,27 ± 0,23*
Лимфоидный ряд в КМ Lymphoid series in BM	102,9 ± 3,9	93,0 ± 9,7	115,2 ± 9,5	103,6 ± 9,0	111,5 ± 14,1
Моноцитарный ряд в КМ Monocytic series in BM	11,9 ± 1,1	14,6 ± 1,5	22,1 ± 2,7*	15,5 ± 2,3	18,3 ± 1,6*
Нейтрофильный ряд в КМ Neutrophilic series in BM	66,6 ± 2,9	60,8 ± 6,7	62,7 ± 5,1	56,5 ± 4,3	68,7 ± 10,5
Гранулоциты в КМ Granulocytes in BM	73,0 ± 3,0	65,8 ± 7,2	71,1 ± 4,9	62,9 ± 5,1	74,8 ± 11,9

Примечание. КМ – костный мозг; ПОМ – полиоксометаллаты. * – p < 0,05 по сравнению с интактной группой; ** – p < 0,05 по сравнению с группой «дериваты» соответствующего срока.

Note. BM, bone marrow; POMs, polyoxometalates. *, p < 0.05 compared to the intact group; **, p < 0.05 compared to the derivatives group of the corresponding period.

 

При подсчете миелограммы установлено отсутствие достоверных изменений количества предшественников лимфоцитов, нейтрофилов и гранулоцитов относительно нормы у крыс, получавших ПОМ и дериваты (табл. 2). Количество клеток моноцитарного ряда в костном мозге животных после семи инъекций ПОМ и дериватов увеличилось, что, вероятно, позволило поддержать в норме количество моноцитов в крови крыс в группах 3 и 5.

Выводы

1. Изменение в периферическом органе иммунопэза, а именно гиперплазия лимфатического аппарата селезенки, наблюдается в большей степени при действии отдельных компонентов наночастиц (дериватов), чем при действии ПОМ.
2. Действие ПОМ и дериватов в меньшей степени проявляется в отношении центральных органов иммунной системы: тимуса и костного мозга.
3. Компенсация дефицита лейкоцитов при введении ПОМ и их дериватов в крови происходит преимущественно за счет лейкопоэза в селезенке.

About the authors

S. A. Titova

Yeltsin Ural Federal University

Email: i.goette@yandex.ru

Postgraduate Student, Junior Researcher at the Laboratory of Nanocluster Polyoxometalates Functional Design of the Research Institute of Physics and Applied Mathematics of the Institute of Natural Sciences and Mathematics

Russian Federation, Ekaterinburg

I. F. Goette

Institute of Immunology and Physiology of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: i.goette@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Researcher at the Laboratory of Morphology and Biochemistry

Russian Federation, Ekaterinburg

M. O. Tonkushina

Yeltsin Ural Federal University

Email: i.goette@yandex.ru

PhD (Chemistry), Senior Researcher at the Research Institute of Physics and Applied Mathematics of the Institute of Natural Sciences and Mathematics

Russian Federation, Ekaterinburg

A. A. Ostroushko

Yeltsin Ural Federal University

Email: i.goette@yandex.ru

PhD, MD (Chemistry), Professor, Chief Researcher, Head of Department at the Research Institute of Physics and Applied Mathematics of the Institute of Natural Sciences and Mathematics

Russian Federation, Ekaterinburg

References

Supplementary files