Effect of extract from bursa Fabricii on immunological parameters of blood in C57Bl/6 mice with cyclophosphamide-induced immunodeficiency

Full Text

Введение

Циклофосфамид (ЦФА) является препаратом алкилирующего действия, который используется для химиотерапевтического лечения онкологических и ряда аутоиммунных заболеваний. Цитотоксическое действие ЦФА проявляется в повреждении ДНК за счет ее алкилирования, что усиливает индукцию апоптоза клеток. Иммуносупрессивное действие препарата, связанное с ингибированием пролиферации клеток миелоидного ростка костного мозга, является ограничивающим фактором использования препарата в клинической практике. Молекулярные механизмы токсичности связаны с изменением передачи сигнала по основным сигнальным путям, включая Nrf2, NF-κB, MAPK/ERK и AKT. Ряд веществ природного и синтетического происхождения способны уменьшать токсичность ЦФА, оказывая защитное действие, восстанавливая нарушенные сигнальные пути [4, 5]. Доказано, что использование антиоксидантов совместно с ЦФА значительно снижает цитотоксическое действие препарата на костный мозг [3]. В настоящее время значительное внимание фармакологов привлекают пептиды, полученные из растительного и животного сырья. Преимуществом экстрагируемых пептидов является их низкая токсичность, низкое количество побочных эффектов, биологическая активность широкого спектра действия [3]. Биорганокомплекс, полученный из фабрициевой сумки цыплят-бройлеров возраста 35-45 дней, имеет широкие перспективы в лечении иммунносупрессивных состояний. Это связано с тем, что в экстракте бурсы содержится большое количество низкомолекулярных пептидов, ростовых факторов, цитокинов, антиоксидантов и ряда других биологически активных веществ. Исследования, проведенные на сельскохозяйственных животных (телята, птицы), выявили, что экстракт бурсы обладает иммуномодулирующим действием, поскольку вызывает усиление гуморального иммунитета при инфекционных заболевания различного генеза [1].

Цель исследования – изучение действия биоорганокомплекса «Бурсанатал», полученного из экстракта бурсы птицы, на иммунологические показатели крови мышей с циклофосфамид-индуцированным подавлением иммунитета.

Материалы и методы

Для получения экстракта бурсы фабрициеву сумку цыплят бройлеров возраста 35-42 дня измельчали, гомогенизировали в водно-солевом растворе с последующей экстракцией и удалением термолабильной фракции. Конечный продукт содержит биологически активные вещества с молекулярной массой от 1 до 10 кДа [2].

Эксперимент проводили на 18 самцах мышей линии C57Bl/6 весом 18-22 г. Животных содержали в одинаковых условиях вивария при контролируемой температуре (22±2 °C) и влажности (50±10%) при соотношении световой и темновой фаз суток 12 часов : 12 часов и свободном доступе к воде и корму. На работу с животными было получено разрешение этического комитета ИИФ УрО РАН.

Были сформированы 3 группы животных: 1. Контрольная группа мышей (n = 6), которой вводили физиологический раствор; 2. Животные (n = 6), которым моделировали иммунодефицит (ЦФА) путем введения ЦФА (Эндоксан^®, Baxter Oncology GmbH, Германия) однократно внутрибрюшинно в дозе 200 мг/кг массы тела животного в виде раствора со стерильным хлоридом натрия 0,9% в концентрации 20 мг/мл; 3. Животные (n = 6), которым на фоне моделирования иммунодефицита внутрибрюшинно вводили экстракт бурсы (ЦФА + «Бурсанатал») на протяжении 7 дней внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл/20 мг массы животного. Для расчета дозы препарата проводился замер массы животных до воздействия.

Мышей выводили из эксперимента через 7 суток под наркозом (за 15-20 минут до эвтаназии вводился 2% «Ксилазин» (1 мл/кг) и «Золетил-100» (0,3 мл/кг) внутримышечно). Проводили замеры массы тела, забор крови из бедренной вены в пробирку с К3-ЭДТА для проведения гематологического анализа и проточной цитофлуорометрии. Анализ периферической крови проводили на автоматизированном гематологическом анализаторе Cеlly 70 (Biocode Hycel), предназначенном для исследования крови животных. Оценку клеточного звена иммунной системы мышей C57BL/6 проводили при помощи проточного цитофлуориметра Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США) и программного обеспечения CXP Cytometer (Beckman Coulter, США). Калибровку прибора выполняли путем оценки стандартизированных флуоресцентных частиц (Flow-Check Fluorospheres (Beckman Coulter, США)). Для окрашивания проб крови применяли моноклональные антитела фирм Invitrogen (США) и BioLegend (США). Процесс пробоподготовки и окрашивания производился согласно прилагаемым производителями инструкций. Применены флуоресцентные красители – FITC, PE, PC5, PC7. В четырехцветном анализе детектировались следующие кластеры дифференцировки: CD45, CD3, CD19, CD49, CD4, CD8, CD5, CD27. Лизис эритроцитов выполняли по безотмывочной технологии с использованием реагентов OptiLyse С (Beckman Coulter, США).

Статистический анализ данных выполнен в пакете статистических программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc. 2001). Данные представлены в виде медианы (Mе), верхнего и нижнего квартилей (Q_0,25-Q_0,75), а также среднего арифметического (М) и ошибки среднего (m). Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовали непараметрический критерий Манна–Уитни (Mann–Whitney U test). При проверке статистических гипотез использовали 5%-ный уровень значимости.

Результаты и обсуждение

Масса мышей C57Bl/6 в контрольной группе не изменилась после введения физраствора, но уменьшилась примерно в 1,1 раза через 7 дней после введения ЦФА, что может быть вызвано с его цитотоксическим действием.

Введение ЦФА мышам C57Bl/6 сопровождалось уменьшением абсолютного и относительного количества лимфоцитов крови почти в 2 раза по сравнению с показателями контрольной группы (табл. 1). В то же время общее количество лейкоцитов не изменялось, так как отмечалось пропорциональное увеличение моноцитов, гранулоцитов, эозинофилов и базофилов. Абсолютная и относительная лимфопения после действия ЦФА подтверждает формирование экспериментального иммунодефицитного состояния и соответствует выбранной экспериментальной модели. Введение экстракта бурсы существенно не повлияло на показатели белой крови у животных группы ЦФА + Бурсанатал.

 

ТАБЛИЦА 1. ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6 ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ЦИКЛОФОСФАМИДА И ЭКСТРАКТА БУРСЫ, M±m

TABLE 1. HEMATOLOGICAL PARAMETERS OF PERIPHERAL BLOOD OF C57BL/6 MICE AFTER ADMINISTRATION OF CYCLOPHOSPHAMIDE AND BURSA EXTRACT, M±m

Показатель Parameter	Контроль Control	Экспериментальный иммунодефицит (ЦФА) Experimental immunodeficiency (CPA)	Экспериментальный иммунодефицит (ЦФА + Бурсанатал) Experimental immunodeficiency (CPA + Bursanatal)
Лейкоциты, 103/мкл Leukocytes, 103/µL	4,05±0,47	4,25±1,61	6,22±0,67*
Лимфоциты, 103/мкл Lymphocytes, 103/µL	3,21±0,36	1,37±0,43*	1,48±0,26*
Средние клетки, 103/мкл Middle cells, 103/µL	0,73±0,10	2,67±1,08*	4,28±0,69*
Гранулоциты, 103/мкл Granulocytes, 103/µL	0,12±0,02	0,22±0,10	0,45±0,09*
Лимфоциты, % Lymphocytes, %	79,50±1,12	34,83±2,24*	24,17±2,06*
Средние клетки, % Middle cells, %	17,67±0,99	60,67±1,86*	68,33±1,36* **
Гранулоциты, % Granulocytes, %	2,83±0,31	4,50±0,50*	7,50±1,28*

Примечание. * – различия с контролем достоверны (U-тест Манна–Уитни, p < 0,05); ** – различия с группой ЦФА достоверны (U-тест Манна–Уитни, p < 0,05).

Note. *, significant differences with control group (Mann–Whitney U test, p < 0.05); **, significant differences with CPA group (Mann–Whitney U test, p < 0.05).

 

У мышей линии C57Bl/6 в ответ на введение ЦФА через 7 суток в периферической крови отмечается Т- и В-клеточная абсолютная и относительная лимфопения (табл. 2), количество натуральных киллеров не меняется, в связи с чем их относительное содержание увеличивается. Т-клеточная лимфопения связана с обеими исследованными субпопуляциями, CD4⁺ и СВ8⁺. Что касается субпопуляций В-лимфоцитов, циклофосфамид-индуцированный иммунодефицит затрагивает B1-, B2-лимфоциты и В-клетки памяти. 7-дневное введение препарата «Бурсанатал» у мышей линии C57Bl/6 приводит к повышению абсолютного и относительного содержания В-лимфоцитов относительно группы ЦФА (табл. 2).

 

ТАБЛИЦА 2. СОДЕРЖАНИЕ ЛИМФОЦИТОВ РАЗЛИЧНЫХ СУБПОПУЛЯЦИЙ У МЫШЕЙ C57BL/6 С ЦИКЛОФОСФАМИД-ИНДУЦИРОВАННЫМ ИММУНОДЕФИЦИТОМ ПОСЛЕ 7-ДНЕВНОГО ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА БУРСАНАТАЛ, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 2. CONTENT OF LYMPHOCYTES OF DIFFERENT SUBPOPULATIONS IN C57BL/6 MICE WITH CYCLOPHOSPHAMIDE-INDUCED IMMUNODEFICIENCY AFTER 7-DAY ADMINISTRATION OF THE BURSANATAL, Me (Q_0,25-Q_0,75)

Показатель Parameter	Контроль Control	Экспериментальный иммунодефицит (ЦФА) Experimental immunodeficiency (CPA)	Экспериментальный иммунодефицит (ЦФА + Бурсанатал) Experimental immunodeficiency (CPA + Bursanatal)
T-лимфоциты, % T cell, %	32,250 (27,300-37,900)	62,800 (59,300-75,000)*	75,950 (70,900-78,100)* **
T-лимфоциты, 109/л T cell, 109/L	1,384 (1,142-1,592)	0,654 (0,511-0,740)*	0,752 (0,681-0,910)*
B-лимфоциты, % В cell, %	60,400 (53,700-63,900)	5,600 (4,500-6,200)*	10,000 (6,900-10,800)* **
B-лимфоциты, 109/л В cell, 109/L	2,268 (2,077-2,945)	0,043 (0,031-0,071)*	0,108 (0,057-0,118)* **
NK-клетки, % NK cell, %	7,900 (7,500-8,900)	28,250 (16,500-33,100)*	11,900 (10,200-22,000)* **
NK-клетки, 109/л NK cell, 109/L	0,318 (0,261-0,410)	0,221 (0,147-0,382)	0,131 (0,094-0,157)*
CD8+ лимфоциты, % CD8+ cell, %	10,750 (10,200-11,800)	24,250 (23,800-24,900)*	28,500 (27,600-30,800)* **
CD8+ лимфоциты, 109/л CD8+ cell, 109/L	0,449 (0,416-0,505)	0,253 (0,160-0,335)*	0,292 (0,264-0,331)*
CD4+ лимфоциты, % CD4+ cell, %	20,350 (16,700-23,400)	37,850 (33,300-43,500)*	45,200 (42,600-45,800)*
CD4+ клетки, 109/л CD4+ cell, 109/L	0,812 (0,691-0,956)	0,359 (0,338-0,384)*	0,443 (0,404-0,533)*
В1-лимфоциты, % В1 cell, %	0,350 (0,200-0,400)	0,100 (0,000-0,200)	0,150 (0,100-0,300)
В1-лимфоциты, 109/л В1 cell, 109/L	0,014 (0,012-0,018)	0,001 (0,000-0,002)*	0,002 (0,001-0,003)*
В-лимфоциты памяти, % B memory cell, %	0,300 (0,100-0,400)	0,000 (0,000-0,000)*	0,050 (0,000-0,100)*
В-лимфоциты памяти, 109/л B memory cell, 109/L	0,013 (0,005-0,013)	0,000 (0,000-0,000)*	0,001 (0,000-0,001)*
В2-лимфоциты, % B2 cell, %	60,005 (53,000-63,450)	5,400 (4,420-5,860)*	9,850 (6,400-10,670)* **
В2-лимфоциты, 109/л B2 cell, 109/L	2,244 (2,058-2,924)	0,043 (0,030-0,069)*	0,105 (0,052-0,116)*

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

Также по сравнению с группой ЦФА увеличивается относительное содержание Т-лимфоцитов, которое, однако, не связано с реальным повышением их количества, имеет место изменение соотношения различных популяций лимфоцитов при действии препарата. Количество натуральных киллеров ниже контроля, как и в группе ЦФА. При этом доля этих клеток выше, чем у здоровых мышей, но ниже, чем в группе с иммунодефицитом без лечения. Наблюдается некоторое повышение относительного количества цитотоксических Т-клеток относительно группы с ЦФА без терапии. Статистически значимо основные субпопуляции В-клеток в группе с лечением препаратом «Бурсанатал» не отличаются от группы ЦФА. Но можно предположить, что повышение количества В-лимфоцитов преимущественно обусловлено субпопуляцией В2-клеток, ответственных за выработку антител к инфекционным агентам.

Выводы

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют, что иммуннодефицитное состояние, вызванное введение ЦФА обусловлено преимущественно уменьшением В2-лимфоцитов, роль которых в иммунном ответе связана со специфической антителопродукцией. При этом отмечается снижение числа В1-лимфоцитов, продуцирующих естественные антитела. Также происходит снижение количества В-клеток памяти. Можно отметить небольшое снижение Т-лимфоцитов, которое происходит как за счет пропорционального уменьшения Т-хелперов и цитотоксических клеток. У мышей линии C57Bl/6 7-дневная терапия препаратом «Бурсанатал» привела к двукратному повышению количества В-лимфоцитов преимущественно за счет продуцирующих специфические антитела клеток. В целом, полученные данные позволяют говорить об отсутствии выраженного иммунотоксического действия исследуемого препарата у животных. Согласно результатам, мы также можем утверждать, активные ингредиенты эктстракта фабрициевой сумки являются хорошими кандидатами для альтернативной адъювантной химиотерапии для снижения иммунотоксичности.

About the authors

N. A. Kolberg

Ural State University of Economics; Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: elena.mukhlynina@yandex.ru

PhD (Veterinary), Director of the Unified Laboratory Complex, Senior Researcher, Laboratory of Morphology and Biochemistry

Russian Federation, Ekaterinburg; Ekaterinburg

Elena A. Mukhlynina

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: elena.mukhlynina@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Morphology and Biochemistry

Russian Federation, Ekaterinburg

Yu. G. Kobelev

V. Yakovlev Ural State Law University

Email: elena.mukhlynina@yandex.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Forensic Science

Russian Federation, Ekaterinburg

I. G. Danilova

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: elena.mukhlynina@yandex.ru

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Laboratory of Morphology and Biochemistry

Russian Federation, Ekaterinburg

References

Supplementary files