Immune cells in experimental model of acute poisoning with acetaminophen

Full Text

Введение

Ацетаминофен (парацетамол) – одно из наиболее распространенных анальгезирующих и антипиретических средств, который входит в состав более 200 лекарственных препаратов, отпускаемых без рецепта [2]. Из-за такого обширного использования часто возникают передозировки данным препаратом, связанные с острой гепатотоксичностью и последующим развитием системного воспаления, ухудшающим прогноз для пациента.

Системное воспаление – это патологический процесс, развивающийся при системном повреждении и характеризующийся тотальной воспалительной реактивностью эндотелиоцитов, плазменных и клеточных факторов крови, соединительной ткани, а на заключительных этапах и микроциркуляторными расстройствами в жизненно важных органах и тканях [5]. При этом системное воспаление характеризуется системной активацией иммунной системы. Однако по данным литературы еще недостаточно изучен вклад разных типов иммунных клеток в патогенез отравления ацетаминофеном, что и определило цель данной работы.

Цель исследования – оценить изменения количества клеток, экспрессирующих CD3⁺, CD20⁺, CD45⁺ в тканях органов мышей линии C57Bl/6 при остром отравлении ацетаминофеном.

Материалы и методы

Исследование было выполнено на половозрелых мышах-самцах линии C57Bl/6. Возраст животных на момент начала эксперимента составлял 10 недель. Все манипуляции с животными были произведены в виварии Института иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук (ИИФ УрО РАН). Организация исследования была одобрена этическим комитетом ФГБУН ИИФ УрО РАН, протокол № 04/22 от 18 ноября 2022 г.

Мыши были разделены на 2 группы по 7 мышей в каждой. В экспериментальную группу входили животные, которым вводили раствор ацетаминофена (Sigma-Aldrich, США) в дозе 600 мг/ кг в концентрации 14 мг/мл. Выбор дозировки препарата был обусловлен ранее проведенными исследованиями [1]. Контрольной группе вводили эквивалентный объём физиологического раствора.

Животных выводили из эксперимента через 24 часа с изофлурановым наркозом (Laboratories Karizoo, Испания), проводя изъятие внутренних органов (печени, почек, поджелудочной железы, легких, сердца). Далее производили фиксацию органов в 10% нейтральном формалине с дальнейшей стандартной гистологической проводкой в автоматизированном тканевом процессоре Leica TP 1020 (Leica Microsystems, Германия). После чего проводили заливку кусочков органов в парафин и изготавливали гистологические срезы толщиной 2-3 мкм.

Для проведения иммуногистохимического исследования на CD3⁺, CD20⁺, CD45⁺ были использованы первичные кроличьи антитела компаний Sigma-Aldrich (США, C7930), Thermo Fisher Scientific (США, PA5-16701), Abcam (Великобритания, ab281586) с разведением дилюентом (Leica Microsystems, Германия) в соотношении 1:500, 1:100, 1:2000 соответственно. Вторичные антитела были взяты компании Thermo Fisher Scientific (США, 31820) в разведении 1:1000.

Анализ окрашенных срезов проводили на световом микроскопе Leica DM2500 (Leica Microsystems, Германия) с видеокамерой Leica DFC420 (Leica Microsystems, Германия). Статистический анализ данных осуществляли с применением программного обеспечения Statistica v. 10 (Statsoft, США).

Результаты и обсуждение

При оценке содержания CD20⁺ клеток в тканях органов мышей C57Bl/6 наблюдали единичные клетки в поле зрения. Статистически значимых различий при этом по U-критерию Манна–Уитни выявлено не было, что говорит об отсутствии вклада B-лимфоцитов в патогенез отравления ацетаминофеном в первые 24 часа.

Было определено статистически значимое снижение количества CD3⁺ клеток в ткани сердца (табл. 1). При этом не отмечается изменения количества CD3+ клеток в ткани печени, как отмечено у O. Krenkel и соавт. [4].

 

Таблица 1. Содержание CD3⁺ клеток в тканях органов мышей линии C57Bl/6 при отравлении ацетаминофеном, Me (Q_0,25-Q_0,75)

Table 1. The content of CD3⁺ cells in the tissues of the organs of the mice of the line C57Bl/6 with acetaminophen poisoning, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Группы (№) Groups (No.) Органы Organs	Контрольная (№ 1) Control (No. 1) n = 7	Экспериментальная (№ 2) Experimental (No. 2) n = 7
Печень Liver	0,01 (0,00-0,09)	0,00 (0,00-0,00)
Почки Kidney	0,01 (0,01-0,02)	0,00 (0,00-0,02)
Легкие Lung	0,31 (0,03-0,39)	0,06 (0,00-0,10)
Поджелудочная железа Pancreas	0,01 (0,01-0,04)	0,00 (0,00-0,01)
Сердце Heart	0,03 (0,01-0,04)**	0,01 (0,00-0,01)*

Примечание. Содержание клеток рассчитано на 10 000 мкм² поля зрения. * – статистически значимые отличия (U-критерий Манна–Уитни, p < 0,05) от группы № 1, ** – статистически значимые отличия (U-критерий Манна–Уитни, p < 0,05) от группы № 2.

Note. The content of cells for 10,000 μM² fields of view is designed. *, statistically significant differences (Mann–Whitney U test, p < 0.05) with group No. 1; **, statistically significant differences (Mann–Whitney U test, p < 0.05) with group No. 2.

 

Через 24 часа после острого отравления ацетаминофеном у экспериментальных животных отмечается увеличение количества CD45⁺ экспрессирующих иммунных клеток в печени (табл. 2), преимущественно за счет сегментоядерных нейтрофилов. Эти данные соотносятся с тем, что нейтрофилы мигрируют в печень к очагам повреждения ткани [4].

 

Таблица 2. Содержание CD45⁺ клеток в тканях органов мышей линии C57Bl/6 при отравлении ацетаминофеном, Me (Q_0,25-Q_0,75)

Table 2. The content of CD45⁺ cells in the tissues of the organs of the mice of the line C57Bl/6 with acetaminophen poisoning, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Группы (№) Groups (No.) Органы Organs	Контрольная (№ 1) Control (No. 1) n = 7	Экспериментальная (№ 2) Experimental (No. 2) n = 7
Печень Liver	0,002 (0,001-0,004)**	0,007 (0,005-0,024)*
Почки Kidney	0,001 (0,000-0,001)	0,001 (0,001-0,001)
Легкие Lung	0,013 (0,006-0,026)	0,022 (0,015-0,024)
Поджелудочная железа Pancreas	0,000 (0,000-0,000)	0,00 (0,00-0,00)
Сердце Heart	0,000 (0,000-0,000)	0,000 (0,000-0,001)

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

При этом можно отметить, что в легких, почках, поджелудочной железе, сердце не отмечается значимых различий по составу иммунных клеток.

Это может быть связано с тем, что 24 часа после введения токсиканта – это переход от стадии раннего восстановления к фазе регенерации после отравления [3], то есть запускаются процессы, связанные с разрешением областей повреждения.

Выводы

Таким образом, в первые сутки после острого отравления ацетаминофеном у экспериментальных животных не отмечается значимого изменения CD3⁺ и CD20⁺ экспрессирующих клеток в тканях. При этом происходит увеличение содержания иммунных клеток в ткани печени, преимущественно за счет нейтрофилов.

About the authors

A. I. Zudova

Institute of Immunology and Physiology of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences; Ural State Medical University

Author for correspondence.
Email: tina.zudova@mail.ru

Junior Researcher at the Laboratory of Inflammation Immunology; Assistant Professor at the Department of Normal Physiology

Russian Federation, Ekaterinburg; Ekaterinburg

K. Yu. Zilber

Ural State Medical University

Email: tina.zudova@mail.ru

Student

Russian Federation, Ekaterinburg

Ya. V. Mishurin

Ural State Medical University

Email: tina.zudova@mail.ru

Student

Russian Federation, Ekaterinburg

S. V. Apanovich

Yeltsin Ural Federal University

Email: tina.zudova@mail.ru

Student

Russian Federation, Ekaterinburg

L. V. Solomatina

Institute of Immunology and Physiology of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: tina.zudova@mail.ru

PhD (Medicine), Senior Researcher at the Laboratory of Inflammation Immunology

Russian Federation, Ekaterinburg

References

Supplementary files