HER2-CAR-NK cells exhibit enhanced cytotoxic activity towards HER2-positive tumors

Nadezhda A. Alekseeva; Алексеева Надежда Алексеевна; Maria A. Streltsova; Стрельцова Мария Алексеевна; Yulia D. Vavilova; Вавилова Юлия Дмитриевна; Sergey M. Deyev; Деев Сергей Михайлович; Elena I. Kovalenko; Коваленко Елена Ивановна

doi:10.46235/1028-7221-17243-HCN

Трансдуцированные HER2-CAR-NK-клетки проявляют повышенную цитотоксическую активность против HER2-позитивных опухолей

Авторы: Алексеева Н.А.¹, Стрельцова М.А.¹, Вавилова Ю.Д.¹, Деев С.М.¹, Коваленко Е.И.¹
Учреждения:
1. ФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук
Выпуск: Том 28, № 4 (2025)
Страницы: 901-906
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 28.04.2025
Дата принятия к публикации: 22.06.2025
Дата публикации: 28.09.2025
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/17243
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-17243-HCN
ID: 17243

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Таргетное воздействие адоптивными иммунными клетками – один из современных и активно развивающихся подходов к терапии солидных опухолей. Экспрессия рецептора эпидермального фактора роста HER2 свойственна для 20% опухолей молочной железы и сопряжена с негативным исходом заболевания. В связи с этим актуальной является задача по получению HER2-специфических клеточных эффекторов, несущих химерный рецептор CAR. NK-клетки, или натуральные киллеры, являются перспективной основой для создания противораковых эффекторов. Они обладают широким арсеналом активирующих рецепторов, способных распознавать опухоль-ассоциированные маркеры, а также, в отличие от T-клеток, не инициируют реакцию «трансплантат против хозяина». Целью данного исследования являлось получение CAR-NK-клеточных эффекторов, способных таргетно элиминировать HER2-позитивные опухолевые мишени. NK-клетки для последующих экспериментов были получены методом негативной магнитной сепарации из периферических мононуклеаров, выделенных из крови добровольцев посредством центрифугирования в градиенте плотности. Модификация NK-клеток, активированных IL-2 и фидерными клетками K562-mbIl21, проводилась методом ретровирусной трансдукции. Для накопления ретровирусных частиц, несущих конструкцию HER2-CAR, были использованы предварительно трансфицированные клетки Phoenix Ampho. В качестве антигенраспознающего домена была использована молекула DARPin 9-29-HER2, обладающая аффинностью к дистальному I домену HER2. Доля трансдуцированных NK-клеток оценивалась по экспрессии репортерного белка GFP, выход рецептора HER2-CAR на поверхность клеточной мембраны детектировался по экспрессии внеклеточного домена c-Myc. Функциональная активность полученных HER2-CAR-NK-клеток оценивалась методом проточной цитометрии по уровню дегрануляции и продукции IFNγ в присутствии HER2-позитивных мишеней BT-474. Чтобы оценить литическую активность HER2-CAR-NK-клеток, методом клеточной сортировки были получены культуры HER2-CAR экспрессирующих GFP⁺NK-клеток и немодифицированных GFP^-NK-клеток. Лизис мишеней BT-474 оценивали по высвобождению кальцеина при инкубации с HER2-CAR и GFP^- эффекторами. Все модифицированные GFP⁺NK-клетки были способны экспрессировать рецептор HER2-CAR на поверхности клеточной мембраны. HER2-CAR-NK-клетки отличались более высоким уровнем дегрануляции и продукции IFNγ по сравнению с GFP^- нетрансдуцированными NK-клетками. Также несущие рецептор HER2-CAR NK-клетки обладали более высокой литической активностью в отношении BT-474. Таким образом, посредством генетической модификации на основе первичных NK-клеток нами были получены высокоэффективные агенты HER2-CAR-NK, способные таргетно распознавать HER2-позитивные опухолевые клетки и реализовывать в их присутствии цитотоксический и цитокинпродуцирующий потенциал. Расширение арсенала клеточных эффекторов, направленных на лечение HER2-позитивных опухолей молочной железы, позволит в перспективе увеличить потенциал персонифицированной терапии опухолей.

Ключевые слова

NK-клетки, химерный антигенный рецептор, CAR, HER2, DARPin, солидные опухоли

Полный текст

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 24-75-00160).

Введение

Среди злокачественных опухолей рак молочной железы занимает второе место по встречаемости среди всей популяции людей в целом и первое место среди женщин. Около 20% опухолей молочной железы характеризуются высоким уровнем экспрессии рецептора эпидермального фактора роста HER2 (Her-2/neu, ERBB2), наличие которого сопряжено с краткими ремиссиями и высоким риском летального исхода [1]. Одним из подходов к таргетной терапии опухолей является адоптивная терапия CAR-лимфоцитами, несущими химерные рецепторы CAR, специфически распознающие опухолевые антигены. Препараты на основе HER2-специфичных CAR-T-клеток, нацеленных на клетки рака молочной железы, находятся на стадии клинических испытаний [2]. Однако NK-клетки, в отличие от T-клеток, не индуцируют реакцию трансплантат против хозяина [3, 4]. На основе клеточной линии лимфомы NK-92 получены эффекторы HER2-CAR-NK92, способные элиминировать HER2-позитивные опухолевые клетки [5]. NK- 92 требуют предварительного облучения перед применением в клинике и характеризуются высоким уровнем экспрессии ингибирующего рецептора NKG2A, что может приводить к сниженной цитотоксической активности в отношении HLA-E-экспрессирующих мишеней. NK-клетки периферической крови, в свою очередь, включают пул зрелых высокотоксичных клеток и не требуют предварительного облучения [6, 7]. Эти свойства делают NK-клетки периферической крови перспективной основой для создания HER2-специфичных CAR-эффекторов для персонифицированной терапии рака молочной железы. Нами были получены HER2-CAR-NK-клетки на основе предварительно активированных in vitro NK-клеток периферической крови. В качестве антиген-распознающего домена рецептора CAR была использована антителоподобная молекула DARPin 9-29-HER2, обладающая высокой аффинностью к дистальному I домену HER2, стабильной структурой и меньшими размерами по сравнению с scFc-доменами полноразмерных антител [8, 9]. Мы также показали, что полученные HER2-CAR-NK-клетки отличаются высокой цитотоксической активностью и высокой продукцией IFNγ в отношении HER2- позитивной линии рака молочной железы BT-474, по сравнению с немодифицированными NK-клетками.

Материалы и методы

NK-клетки были изолированы методом негативной магнитной сепарации (Miltenyi Biotec, Германия) из PBMC, предварительно полученных посредством центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки культивировались в среде из 50% NK MACS Medium (Miltenyi Biotec, Германия) и полной среды DMEM (НПП «ПанЭко», Россия) (с 10%-ной фетальной бычьей сывороткой, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками-антимикотиками (1/100)), и активировались облученными (100 Гр) фидерными клетками K562-mbIL21 и 100 Ед/мЛ IL-2 (Hoffmann La-Roche, Швейцария) в течение 3-5 дней при 5% CO2, 37 °C. Клеточные линии Phoenix Ampho и BT-474 культивировались в полной среде DMEM, 5% CO2, 37 °C. Вектор GFP-9-29-HER2-CAR (далее – HER2-CAR) состоит из: DARPin 9-29 – модуля распознавания антигена; EF1a – конститутивного человеческого промотора hEF1a; c-myc – внеклеточного фрагмента для детекции CAR; IgG1 – модуля-пространства из человеческого IgG1; CD28-CD3 cyto – сигнального региона; GFP – репортерного белка. Ретровирусный вектор GFP-9-29-HER2-CAR был псевдотипирован плазмидой с гликопротеином оболочки RD-114. Плазмиды были сотрансфицированы в соотношении 2:1. Трансфекция линии Phoenix Ampho (любезно предоставлена д.б.н., профессором Александром Филатовым (Институт Иммунологии, Россия), проводилась в чашках Петри, обработанных поли-L-лизином (0,5 мг/мл), с использованием набора для трансфекции на основе кальций-фосфата в среде DMEM c 3% FBS. Супернатанты c ретровирусными векторами собирались через 48 часов и концентрировались ультрацентрифугированием. Трандукция NK-клеток проводилась в планшетах, обработанных раствором ретронектина с концентрацией 20 нг/ мл (Clontech/Takara, США). Эффективность транcдукции оценивалась по флуоресценции GFP и экспрессии поверхностного c-myc с помощью проточной цитометрии через 3-5 дней после трансдукции. Дегрануляция и продукция IFNγ NK-клетками оценивалась с помощью проточной цитометрии (LongCyte, Challenbio). NK-клетки инкубировались с BT-474 в полной среде DMEM, с добавлением антител anti-CD107a-PE (Miltenyi Biotec, Германия) и брефелдином A (10 мкг/мл, Invitrogen, США) E:T = 1:1, t = 2,5 ч, 37 °C, 5% CO₂. Уровень внутриклеточной продукции оценивался посредством внутриклеточного окрашивания антителами IFNγ-PE (Miltenyi Biotec, Германия) NK-клеток после инкубации с BT-474 в течение 4 часов, E:T = 1:1. HER2-CAR- NK-клетки были отсортированы с использованием клеточного сортировщика FACSVantage DiVa (Becton Dickinson, США) для получения фракций GFP^- и GFP⁺. Литическая активность HER- CAR-NK-клеток и GFP^-NK-клеток оценивалась по высвобождению кальцеина (λexc = 490 нм и λem = 510-570 нм, спектрофлуориметр Glomax Multi (Promega, США)) в супернатант клетками BT-474, которые были предварительно маркированы Calcein-AM (2,5 мкМ) (Biozol, Германия). E:T = 1:1, t = 4 часа, 37 °C, 5% CO2. Отрицательный контроль (neg) – интактные клетки BT-474, положительный (pos) – клетки BT-474, лизированные 1% Triton X-100 (Am-O694-0.1, США). Долю лизированных клеток определяли по формуле: % = 100 × (MFI – MFIneg) / (MFIpos – MFI).

Результаты и обсуждение

NK-клетки периферической крови, предварительно активированные in vitro, были трансдуцированы ретровирусным вектором, содержащим конструкцию HER2-CAR. Доля трансдуцированных клеток в культуре была оценена по экспрессии репортерной молекулы GFP, включенной в генетическую конструкцию HER2-CAR (рис. 1А). Также по экспрессии внеклеточного домена HER2-CAR c-Myc был подтвержден выход рецепторов CAR на поверхность во всех трансдуцированных GFP⁺NK-клетках (рис. 1Б).

Рисунок 1. Получение HER2-CAR-NK-клеток

Примечание. А – доля трансдуцированных GFP⁺NK-клеток, несущих конструкцию HER2-CAR. Б – демонстрация выхода рецептора HER2-CAR на поверхность клеточной мембраны трансдуцированных GFP⁺NK-клеток по уровню экспрессии внеклеточного домена HER2-CAR (c-Myc).

Figure 1. Obtaining of HER2-CAR-NK cells

Note. A, the proportion of transduced GFP⁺NK cells carrying the HER2-CAR construct. B, demonstration of the release of the HER2-CAR receptor onto the surface of the cell membrane of transduced GFP⁺NK cells by the expression level of HER2-CAR extracellular domain (c-Myc).

Функциональная активность полученных HER2-CAR-NK-клеток была исследована в отношении HER2-экспрессирующей линии рака молочной железы BT-474. Посредством проточной цитометрии был оценен уровень экспрессии HER2 на поверхности клеток-мишеней BT-474 – клетки обладали высоким уровнем экспрессии таргетной молекулы (рис. 2А). При коинкубации с BT-474 во фракции HER2-CAR-NK-клеток (GFP⁺) наблюдалась большая доля дегранулирующих клеток CD107a⁺ по сравнению с немодифицированными GFP^-NK-клетками (рис. 2Б). Также HER2-CAR-NK-клетки отличались более выраженной продукцией IFNγ по сравнению с GFP^-NK-клетками (рис. 2В). Посредством кальцеинового теста была детектирована повышенная литическая активность модифицированных HER2-CAR-NK-клеток (рис. 2Г). В то же время, немодифицированные GFP^-NK-клетки также были способны лизировать опухолевые мишени, дегранулировать и продуцировать IFNγ в их присутствии (рис. 2Б, В, Г). Помимо взаимодействия CAR и таргетной молекулы HER2 множество осей рецептор-лиганд принимают участие в противоопухолевой реакции NK-клеток, что обеспечивает сохранение противоопухолевого потенциала NK-клеток против гетерогенных опухолей или при потере экспрессии HER2. Так, например, известно, что в элиминации BT-474 принимают участие высокодифференцированные CX3CR1⁺NK-клетки, а менее дифференцированные NKG2D⁺NK-клетки вносят менее выраженный вклад [10]. Также BT-474 несут две аллели HLA-C1, что делает их более восприимчивыми к NK-клеткам, не экспрессирующим ингибирующие рецепторы KIR2DL2/3, которые присутствуют в пуле NK-клеток периферической крови большинства индивидов [11].

Рисунок 2. Функциональная активность HER2-CAR-NK-клеток при инкубации с HER2⁺ мишенями BT-474

Примечание. А – уровень экспрессии HER2 на поверхности клеток-мишеней BT-474. Б – доля дегранулировавших CD107a⁺, HER2-CAR-NK-клеток (GFP⁺) и GFP^- NK-клеток при инкубации с HER2⁺ мишенями BT-474. В – доля HER2-CAR-NK-клеток (GFP⁺) и GFP^-NK-клеток, продуцирующих IFNγ при инкубации c BT-474. Г – доля лизированных BT-474 при инкубации с HER2-CAR-NK-клетками (GFP⁺) и GFP^-NK-клетками. Данные представлены в виде среднее ± SD, статистический анализ данных проведен посредством t-теста Стьюдента, * – p < 0,05.

Figure 2. Functional activity of HER2-CAR-NK cells upon incubation with HER2⁺BT-474 targets

Note. A, the level of HER2 expression on the surface of BT-474 target cells. B, the proportion of degranulated CD107a⁺, HER2-CAR-NK cells (GFP⁺) and GFP^-NK cells upon incubation with HER2⁺BT-474 targets. C, the proportion of HER2-CAR-NK cells (GFP⁺) and GFP^-NK cells producing IFNγ upon incubation with BT-474. D, the proportion of lysed BT-474 upon incubation with HER2-CAR-NK cells (GFP⁺) and GFP^-NK cells. Data are presented as mean ± SD, statistical analysis of data was performed using Student’s t-test; *, p < 0.05.

Заключение

Таким образом, на основе активированных первичных NK-клеток, обладающих натуральной противоопухолевой активностью, были получены HER2-направленные CAR-NK-клетки.

Об авторах

Надежда Алексеевна Алексеева

ФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: nadalex@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0001-6221-5478

аспирант, младший научный сотрудник отдела иммунологии, лаборатория клеточных взаимодействий