HER2-CAR-NK cells exhibit enhanced cytotoxic activity towards HER2-positive tumors

Nadezhda A. Alekseeva; Алексеева Надежда Алексеевна; Maria A. Streltsova; Стрельцова Мария Алексеевна; Yulia D. Vavilova; Вавилова Юлия Дмитриевна; Sergey M. Deyev; Деев Сергей Михайлович; Elena I. Kovalenko; Коваленко Елена Ивановна

doi:10.46235/1028-7221-17243-HCN

HER2-CAR-NK cells exhibit enhanced cytotoxic activity towards HER2-positive tumors

Authors: Alekseeva N.A.¹, Streltsova M.A.¹, Vavilova Y.D.¹, Deyev S.M.¹, Kovalenko E.I.¹
Affiliations:
1. Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences
Issue: Vol 28, No 4 (2025)
Pages: 901-906
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 28.04.2025
Accepted: 22.06.2025
Published: 28.09.2025
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/17243
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-17243-HCN
ID: 17243

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Targeting of adoptive immune cells is among modern approaches to therapy of solid tumors. Expression of an epidermal growth factor receptor HER2 is a common finding (20% of breast tumors) and is associated with a negative outcome. In this regard, obtaining HER2-specific effector cells carrying a chimeric CAR receptor is a relevant task. NK cells have a wide spectrum of activating receptors capable of recognizing tumor-associated markers and do not initiate a graft-versus-host reaction. The goal of this study was to obtain effector CAR-NK cells capable of eliminating the HER2-positive tumor targets. The NK cells were obtained by negative magnetic separation from peripheral mononuclear cells isolated from volunteers’ blood using density gradient centrifugation. Activated NK cells were modified by retroviral transduction. Preliminarily transfected Phoenix Ampho cells were used to accumulate retroviral particles carrying HER2- CAR construct. The DARPin 9-29-HER2 molecule with affinity for the HER2 distal domain I was used as the antigen-recognizing domain. The proportion of transduced NK cells was measured by means of GFP reporter protein expression. The surface emergence of HER2-CAR receptors was detected by expression of the c-Myc extracellular domain. All modified GFP⁺NK cells were capable of expressing HER2-CAR receptors on the cell membrane. Functional activity of HER2-CAR NK cells was measured using flow cytometry, by degranulation intensity and IFNγ production in the presence of HER2-positive target cells BT-474. To assess lytic activity of HER2-CAR NK cells, the cultures of HER2-CAR-expressing GFP⁺NK cells and unmodified GFP^-NK cells were obtained by cell sorting. Lysis of BT-474 targets was measured by calcein release upon incubation with HER2-CAR and GFP^- effectors. HER2-CAR NK cells were characterized by higher levels of degranulation and IFNγ production compared to GFP^-NK cells. Moreover, HER2-CAR-NK cells had higher lytic activity towards BT-474. Thus, by means of genetic modification based on primary NK cells, we obtained highly effective HER2-CAR-NK agents capable of HER2-positive target recognition and possessing cytotoxic and cytokine-producing potential in presence of tumor cells. Expanding the variety of cellular effectors aimed at treating HER2-positive breast tumors will increase the potential of personalized tumor therapy in the future.

Keywords

NK cells, chimeric antigen receptor, CAR, HER2, DARPin, solid tumors

Full Text

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 24-75-00160).

Введение

Среди злокачественных опухолей рак молочной железы занимает второе место по встречаемости среди всей популяции людей в целом и первое место среди женщин. Около 20% опухолей молочной железы характеризуются высоким уровнем экспрессии рецептора эпидермального фактора роста HER2 (Her-2/neu, ERBB2), наличие которого сопряжено с краткими ремиссиями и высоким риском летального исхода [1]. Одним из подходов к таргетной терапии опухолей является адоптивная терапия CAR-лимфоцитами, несущими химерные рецепторы CAR, специфически распознающие опухолевые антигены. Препараты на основе HER2-специфичных CAR-T-клеток, нацеленных на клетки рака молочной железы, находятся на стадии клинических испытаний [2]. Однако NK-клетки, в отличие от T-клеток, не индуцируют реакцию трансплантат против хозяина [3, 4]. На основе клеточной линии лимфомы NK-92 получены эффекторы HER2-CAR-NK92, способные элиминировать HER2-позитивные опухолевые клетки [5]. NK- 92 требуют предварительного облучения перед применением в клинике и характеризуются высоким уровнем экспрессии ингибирующего рецептора NKG2A, что может приводить к сниженной цитотоксической активности в отношении HLA-E-экспрессирующих мишеней. NK-клетки периферической крови, в свою очередь, включают пул зрелых высокотоксичных клеток и не требуют предварительного облучения [6, 7]. Эти свойства делают NK-клетки периферической крови перспективной основой для создания HER2-специфичных CAR-эффекторов для персонифицированной терапии рака молочной железы. Нами были получены HER2-CAR-NK-клетки на основе предварительно активированных in vitro NK-клеток периферической крови. В качестве антиген-распознающего домена рецептора CAR была использована антителоподобная молекула DARPin 9-29-HER2, обладающая высокой аффинностью к дистальному I домену HER2, стабильной структурой и меньшими размерами по сравнению с scFc-доменами полноразмерных антител [8, 9]. Мы также показали, что полученные HER2-CAR-NK-клетки отличаются высокой цитотоксической активностью и высокой продукцией IFNγ в отношении HER2- позитивной линии рака молочной железы BT-474, по сравнению с немодифицированными NK-клетками.

Материалы и методы

NK-клетки были изолированы методом негативной магнитной сепарации (Miltenyi Biotec, Германия) из PBMC, предварительно полученных посредством центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки культивировались в среде из 50% NK MACS Medium (Miltenyi Biotec, Германия) и полной среды DMEM (НПП «ПанЭко», Россия) (с 10%-ной фетальной бычьей сывороткой, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками-антимикотиками (1/100)), и активировались облученными (100 Гр) фидерными клетками K562-mbIL21 и 100 Ед/мЛ IL-2 (Hoffmann La-Roche, Швейцария) в течение 3-5 дней при 5% CO2, 37 °C. Клеточные линии Phoenix Ampho и BT-474 культивировались в полной среде DMEM, 5% CO2, 37 °C. Вектор GFP-9-29-HER2-CAR (далее – HER2-CAR) состоит из: DARPin 9-29 – модуля распознавания антигена; EF1a – конститутивного человеческого промотора hEF1a; c-myc – внеклеточного фрагмента для детекции CAR; IgG1 – модуля-пространства из человеческого IgG1; CD28-CD3 cyto – сигнального региона; GFP – репортерного белка. Ретровирусный вектор GFP-9-29-HER2-CAR был псевдотипирован плазмидой с гликопротеином оболочки RD-114. Плазмиды были сотрансфицированы в соотношении 2:1. Трансфекция линии Phoenix Ampho (любезно предоставлена д.б.н., профессором Александром Филатовым (Институт Иммунологии, Россия), проводилась в чашках Петри, обработанных поли-L-лизином (0,5 мг/мл), с использованием набора для трансфекции на основе кальций-фосфата в среде DMEM c 3% FBS. Супернатанты c ретровирусными векторами собирались через 48 часов и концентрировались ультрацентрифугированием. Трандукция NK-клеток проводилась в планшетах, обработанных раствором ретронектина с концентрацией 20 нг/ мл (Clontech/Takara, США). Эффективность транcдукции оценивалась по флуоресценции GFP и экспрессии поверхностного c-myc с помощью проточной цитометрии через 3-5 дней после трансдукции. Дегрануляция и продукция IFNγ NK-клетками оценивалась с помощью проточной цитометрии (LongCyte, Challenbio). NK-клетки инкубировались с BT-474 в полной среде DMEM, с добавлением антител anti-CD107a-PE (Miltenyi Biotec, Германия) и брефелдином A (10 мкг/мл, Invitrogen, США) E:T = 1:1, t = 2,5 ч, 37 °C, 5% CO₂. Уровень внутриклеточной продукции оценивался посредством внутриклеточного окрашивания антителами IFNγ-PE (Miltenyi Biotec, Германия) NK-клеток после инкубации с BT-474 в течение 4 часов, E:T = 1:1. HER2-CAR- NK-клетки были отсортированы с использованием клеточного сортировщика FACSVantage DiVa (Becton Dickinson, США) для получения фракций GFP^- и GFP⁺. Литическая активность HER- CAR-NK-клеток и GFP^-NK-клеток оценивалась по высвобождению кальцеина (λexc = 490 нм и λem = 510-570 нм, спектрофлуориметр Glomax Multi (Promega, США)) в супернатант клетками BT-474, которые были предварительно маркированы Calcein-AM (2,5 мкМ) (Biozol, Германия). E:T = 1:1, t = 4 часа, 37 °C, 5% CO2. Отрицательный контроль (neg) – интактные клетки BT-474, положительный (pos) – клетки BT-474, лизированные 1% Triton X-100 (Am-O694-0.1, США). Долю лизированных клеток определяли по формуле: % = 100 × (MFI – MFIneg) / (MFIpos – MFI).

Результаты и обсуждение

NK-клетки периферической крови, предварительно активированные in vitro, были трансдуцированы ретровирусным вектором, содержащим конструкцию HER2-CAR. Доля трансдуцированных клеток в культуре была оценена по экспрессии репортерной молекулы GFP, включенной в генетическую конструкцию HER2-CAR (рис. 1А). Также по экспрессии внеклеточного домена HER2-CAR c-Myc был подтвержден выход рецепторов CAR на поверхность во всех трансдуцированных GFP⁺NK-клетках (рис. 1Б).

Рисунок 1. Получение HER2-CAR-NK-клеток

Примечание. А – доля трансдуцированных GFP⁺NK-клеток, несущих конструкцию HER2-CAR. Б – демонстрация выхода рецептора HER2-CAR на поверхность клеточной мембраны трансдуцированных GFP⁺NK-клеток по уровню экспрессии внеклеточного домена HER2-CAR (c-Myc).

Figure 1. Obtaining of HER2-CAR-NK cells

Note. A, the proportion of transduced GFP⁺NK cells carrying the HER2-CAR construct. B, demonstration of the release of the HER2-CAR receptor onto the surface of the cell membrane of transduced GFP⁺NK cells by the expression level of HER2-CAR extracellular domain (c-Myc).

Функциональная активность полученных HER2-CAR-NK-клеток была исследована в отношении HER2-экспрессирующей линии рака молочной железы BT-474. Посредством проточной цитометрии был оценен уровень экспрессии HER2 на поверхности клеток-мишеней BT-474 – клетки обладали высоким уровнем экспрессии таргетной молекулы (рис. 2А). При коинкубации с BT-474 во фракции HER2-CAR-NK-клеток (GFP⁺) наблюдалась большая доля дегранулирующих клеток CD107a⁺ по сравнению с немодифицированными GFP^-NK-клетками (рис. 2Б). Также HER2-CAR-NK-клетки отличались более выраженной продукцией IFNγ по сравнению с GFP^-NK-клетками (рис. 2В). Посредством кальцеинового теста была детектирована повышенная литическая активность модифицированных HER2-CAR-NK-клеток (рис. 2Г). В то же время, немодифицированные GFP^-NK-клетки также были способны лизировать опухолевые мишени, дегранулировать и продуцировать IFNγ в их присутствии (рис. 2Б, В, Г). Помимо взаимодействия CAR и таргетной молекулы HER2 множество осей рецептор-лиганд принимают участие в противоопухолевой реакции NK-клеток, что обеспечивает сохранение противоопухолевого потенциала NK-клеток против гетерогенных опухолей или при потере экспрессии HER2. Так, например, известно, что в элиминации BT-474 принимают участие высокодифференцированные CX3CR1⁺NK-клетки, а менее дифференцированные NKG2D⁺NK-клетки вносят менее выраженный вклад [10]. Также BT-474 несут две аллели HLA-C1, что делает их более восприимчивыми к NK-клеткам, не экспрессирующим ингибирующие рецепторы KIR2DL2/3, которые присутствуют в пуле NK-клеток периферической крови большинства индивидов [11].

Рисунок 2. Функциональная активность HER2-CAR-NK-клеток при инкубации с HER2⁺ мишенями BT-474

Примечание. А – уровень экспрессии HER2 на поверхности клеток-мишеней BT-474. Б – доля дегранулировавших CD107a⁺, HER2-CAR-NK-клеток (GFP⁺) и GFP^- NK-клеток при инкубации с HER2⁺ мишенями BT-474. В – доля HER2-CAR-NK-клеток (GFP⁺) и GFP^-NK-клеток, продуцирующих IFNγ при инкубации c BT-474. Г – доля лизированных BT-474 при инкубации с HER2-CAR-NK-клетками (GFP⁺) и GFP^-NK-клетками. Данные представлены в виде среднее ± SD, статистический анализ данных проведен посредством t-теста Стьюдента, * – p < 0,05.

Figure 2. Functional activity of HER2-CAR-NK cells upon incubation with HER2⁺BT-474 targets

Note. A, the level of HER2 expression on the surface of BT-474 target cells. B, the proportion of degranulated CD107a⁺, HER2-CAR-NK cells (GFP⁺) and GFP^-NK cells upon incubation with HER2⁺BT-474 targets. C, the proportion of HER2-CAR-NK cells (GFP⁺) and GFP^-NK cells producing IFNγ upon incubation with BT-474. D, the proportion of lysed BT-474 upon incubation with HER2-CAR-NK cells (GFP⁺) and GFP^-NK cells. Data are presented as mean ± SD, statistical analysis of data was performed using Student’s t-test; *, p < 0.05.

Заключение

Таким образом, на основе активированных первичных NK-клеток, обладающих натуральной противоопухолевой активностью, были получены HER2-направленные CAR-NK-клетки.