Immunoregulatory effects of local and systemic use of melatonin in experimental thermal trauma

Full Text

Введение

Ожоговая травма является одной из ключевых медицинских и социальных проблем. Несмотря на значительные достижения в комбустиологии, медленное заживление и присоединение инфекции являются ключевыми проблемами у пациентов с ожогами, которые приводят к удлинению госпитализации, снижению качества жизни и эмоциональным расстройствам [1]. До 70% всех осложнений после термической травмы (ТТ) связаны с инфекциями, в первую очередь пневмонией и инфекциями мочевыводящих путей. Развитие инфекционных осложнений, включая сепсис, после ТТ связано с иммуносупрессивными реакциями как компенсации длительного стабильного провоспалительного ответа, особенно в связи с избыточным синтезом перепроизводства IL-10, IL-4, TNFα, TGF-β [2]. Иммунные реакции занимают ключевое место в патогенезе ТТ и ее осложнений на каждом этапе, понимание патофизиологии ожогов является предпосылкой для разработки патогенетически обоснованных методов терапии, а также методов безопасной некрэктомии и ушивания ран [3]. В этом отношении особый интерес представляют эндогенные регуляторы гомеостаза, которые могут вмешиваться в нарастающий иммунный ответ на ТТ и быть задействованы в качестве иммунокорректоров.

Ранее мы показали, что применение эритропоэтина локально и системно, а также местное введение EGF при ТТ ускоряют заживление ожоговой травмы и восстановление иммунного статуса в клинических и экспериментальных условиях [4, 5]. Мелатонин (МТ) регулирует гомеостаз, оказывая плейотропные эффекты: регуляция цикла сон-бодрствование (изменение ритма секреции МТ при ТТ рассматривается как ключевой фактор нарушений сна), редокс-фактора с преобладающим антиоксидантным действием, про- и противовоспалительный, иммуномодулирующий, антиапоптогенный, регулирующий клеточную пролиферацию и дифференцировку [6]. Клетки кожи вырабатывают МТ, его метаболиты обнаруживаются в кератиноцитах, меланоцитах, фибробластах кожи [7]. Рецепторы MT1, MT2, RORa обнаружены в кератиноцитах, фибробластах кожи, клетках волосяного фолликула и дермальных кровеносных сосудов, а также в меланоцитах [8].

В настоящее время фармацевтические формы МТ для местного применения при повреждениях кожи недоступны в РФ, а пероральные формы МТ не показаны для применения при ТТ.

Цель работы – изучить влияние локального в составе оригинальной дермальной пленки и системного применения мелатонина на концентрацию TNFα и IL-4 в сыворотке при экспериментальной термической травме.

Материалы и методы

Экспериментальные исследования выполнены на 109 крысах линии Wistar массой 240-250 г в экспериментально-биологической клинике (виварии) ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России. Эксперимент проводился при строгом соблюдении требований по уходу и содержанию животных, а также выводу их из эксперимента с последующей утилизацией в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS № 123 от 18.03.1986, Страсбург), Рекомендациями Европейской Комиссии 2007/526/EC от 18 июня 2007 года, Директивой 2010/63/EU европейского парламента и совета европейского союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях. Организация исследования одобрена этическим комитетом Южно-Уральского государственного медицинского университета, протокол № 10 от 15.11.2019, протокол № 13 28.12.2020.

Животные были случайным образом разделены на 4 группы: группа 1 (n = 26) – интактный контроль, группа 2 (n = 44) – животные с ТТ и ежедневным наложением асептической повязки (ТТ + АсП), группа 3 (n = 38) – животные с ТТ с наложением асептической повязки и наложением дермальной пленки с мелатонином (Flamma SpA, Италия) в ежедневной разовой дозе 5 мг/г в течение 5 суток (ТТ + МТ ДП), группа 4 (n = 39) – животные с ТТ с наложением асептической повязки и внутрибрюшинным введением мелатонина (Flamma SpA, Италия) в ежедневной разовой дозе 10 мг/кг в течение 5 суток (ТТ + МТ). Для моделирования ТТ IIIА степени и относительной площадью 3,5% изолированный межлопаточный участок кожи крысы погружали в очищенную воду при 98-99 °С на 12 с. Глубину ожога верифицировали морфологическими методами. Для анестезии использовали препарат «Золетил-100» (Virbac SanteAnimale, Фpaнция) в дозе 20 мг/кг.

ДП изготавливали на основе 4%-ного водного раствора натрий-карбоксиметилцеллюлозы (NaКМЦ) и глицерина. В качестве действующего вещества вводили спиртовой раствор МТ («ФЛАММА С.П.А.», Италия). Площадь одной ДП составила 12 см², масса – 6,0 г, содержание МТ – 0,03 г. Концентрация МТ в ДП 5 мг/г (патент № 2751048).

На 5-е, 10-е и 20-е сутки от момента индукции ТТ в группах осуществлялся забор крови под наркозом после торакотомии пункцией сердца в области левого желудочка в вакуумные пробирки Vacuette (Greiner BioOne, Австрия). Концентрацию в сыворотке IL-4, TNFα определяли на автоматическом иммуноферментном анализаторе Personal LAB (Италия) с применением специфических для крыс тест-систем Cloud-Clone Corp. (Китай) результаты выражали в пг/мл.

Скорость эпителизации (VS) рассчитывали по формуле:

VS = S – S_n / t,

где S – начальная площадь раны (в дальнейшем площадь при предыдущем измерении); S_n – площадь при последующем измерении; t – число дней между измерениями [2]. Площадь ожоговой раны в последующих измерениях определяли в %, принимая за 100% площадь раны при предыдущем измерении, результат выражали в % за сутки.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics 19. Характеристика выборок представлена в формате “Me (Q_0,25-Q_0,75)”, где Мe – медиана, Q_0,25 и Q_0,75 – значение нижнего и верхнего квартиля соответственно. Значимость различий между группами оценивали при помощи критериев Краскела–Уоллиса, Манна–Уитни. С целью выявления взаимосвязей между исследуемыми параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена (R).

Результаты

При ТТ от 5-х к 20-м суткам эксперимента увеличивается скорость эпителизации раны. В динамике ТТ на 10 сутки скорость эпителизации выше (р < 0,01), чем на 5-е сутки, на 20-е сутки выше (р < 0,01), чем на 10-е и 5-е сутки (табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА СКОРОСТЬ ЭПИТЕЛИЗАЦИИ, КОНЦЕНТРАЦИЮ В СЫВОРОТКЕ TNFα И IL-4 ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТТ, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. EFFECT OF MELATONIN ON THE RATE OF EPITHELIALIZATION, SERUM CONCENTRATIONS OF TNFα AND IL-4 IN EXPERIMENTAL TT, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Показатель Indicator	Группа 1 Интактные Group 1 Intact (n = 12)	Группа 2 ТТ + АсП Group 2 TT + AsB			Группа 3 ТТ + МТ ДП Group 3 TT + MT DM			Группа 4 ТТ + МТ Group 4 TT + MT
		5-е сутки 5th day (n = 12)	10-е сутки 10th day (n = 20)	20-е сутки 20th day (n = 17)	5-е сутки 5th day (n = 14)	10-е сутки 10th day (n = 20)	20-е сутки 20th day (n = 17)	5-е сутки 5th day (n = 16)	10-е сутки 10th day (n = 16)	20-е сутки 20th day (n = 7)
Скорость эпителизации, % / сутки Epithelialization rate, % / day	0	0,89 (0,86- 0,89) *	1,90 (1,88- 1,95) * &	2,26 (2,14- 2,55) * & ^	1,33 (1,29- 1,35) * #	6,57 (5,92- 6,93) * # &	14,30 (13,38- 15,17) * # & ^	1,15 (1,04- 1,22) * $	2,90 (2,62- 3,27) * # $ &	8,89 (7,80- 9,90) * # $ & ^
TNFα, пг/мл TNFα, pg/mL	1,18 (0,84-1,96)	2,25 (2,02- 2,92) *	3,42 (2,72- 6,14) * &	3,48 (1,77- 5,05) *	1,77 (1,07- 2,30) #	1,96 (1,35- 4,32) * # &	1,57 (1,35- 2,69) * # &	2,33 (1,85- 3,03) * $	2,69 (2,19- 3,03) * #	1,91 (1,35- 3,03) * #
IL-4, пг/мл IL-4, pg/mL	0,79 (0,50-1,75)	1,93 (1,36- 2,51) *	3,26 (2,58- 5,65) * &	2,97 (1,57- 4,97) * &	1,72 (1,36- 1,86) *	2,36 (1,29- 4,22) * # &	2,08 (1,29- 2,65) *	2,11 (1,79- 2,86) * $	2,79 (2,43- 3,36) * &	2,18 (1,79- 3,01) *

Примечание. * – значимые (р < 0,01) различия с группой 1 на соответствующие сутки, ^# – с группой 2 на соответствующие сутки, ^$ – с группой 3 на соответствующие сутки, ^& – внутри групп на 5-е сутки, ^ – внутри групп на 10-е сутки.

Note. *, significant (p < 0.01) differences with group 1 on the corresponding day; ^#, with group 2 on the corresponding day; ^$, with group 3 on the corresponding day; ^&, within groups on the 5^th day; ^, within groups on the 10^th day.

 

При ТТ на 5-е, 10-е и 20-е сутки в сыворотке зафиксировано увеличение концентрации TNFα, IL-4. В динамике ТТ концентрация TNFα и IL-4 на 10-е сутки ТТ была выше, чем на 5-е сутки, и не отличается от значений на 20-е сутки, что позволяет говорить о максимальном уровне TNFα и IL-4 на 10-е сутки.

Нами проведена корреляция между скоростью эпителизации раны и концентрацией в сыворотке TNFα и IL-4 (табл. 2). Выявлена на 10 и 20 сутки ТТ умеренная положительная связь скорости эпителизации раны с концентрацией TNFα и IL-4.

 

ТАБЛИЦА 2. КОРРЕЛЯЦИЯ МЕЖДУ СКОРОСТЬЮ ЭПИТЕЛИЗАЦИИ РАНЫ И КОНЦЕНТРАЦИЕЙ В СЫВОРОТКЕ TNFα И IL-4 ПРИ ТТ

TABLE 2. CORRELATION BETWEEN THE RATE OF WOUND EPITHELIALIZATION AND SERUM CONCENTRATIONS OF TNFα AND IL-4 IN TT

Показатель Indicator	Группа 2 ТТ + АсП Group 2 TT + AsB			Группа 3 ТТ + МТ ДП Group 3 TT + MT DM			Группа 4 ТТ + МТ Group 4 TT + MT
	5-е сутки 5th day (n = 12)	10-е сутки 10th day (n = 20)	20-е сутки 20th day (n = 17)	5-е сутки 5th day (n = 14)	10-е сутки 10th day (n = 20)	20-е сутки 20th day (n = 17)	5-е сутки 5th day (n = 16)	10-е сутки 10th day (n = 16)	20-е сутки 20th day (n = 7)
TNFα, пг/мл TNFα, pg/mL	0,28	0,55	0,64	-0,53	-0,77	-0,75	0,54	-0,48	-0,50
IL-4, пг/мл IL-4, pg/mL	0,32	0,48	0,46	0,30	-0,78	0,66	0,30	0,36	0,31

Примечание. Полужирным шрифтом выделены значимые (р < 0,05) связи.

Note. Significant (p < 0.05) connections are highlighted in bold.

 

В условиях применения ДП с МТ при ТТ на 5, 10 и 20 сутки зафиксировано увеличение скорости эпителизации раны (табл. 1). В динамике на 10 и 20 сутки по сравнению с 5 сутками и на 20 сутки по сравнению с 5 и 10 сутками скорость эпителизации раны увеличивается.

Применение МТ в составе ДП на 5, 10 и 20 сутки в сыворотке снижается концентрация TNFα, а концентрация IL-4 снижается только на 10 сутки (табл. 1). Наиболее выраженный эффект отмечен при оценке концентрации TNFα, которая снижалась во все сроки наблюдения и на 10 и 20 сутки значимо отличалась от значений в группе интактных животных, то есть восстанавливалась частично. Концентрация в сыворотке IL-4 на 5, 10 и 20 сутки ТТ была значимо выше, чем в группе интактных животных.

Нами с использованием корреляционного анализа между скоростью эпителизации раны при ТТ установлены следующие значимые связи с концентрацией в сыворотке TNFα: на 5-е сутки – умеренная отрицательная связь, на 10-е и 20-е сутки – сильная отрицательная связь; с концентрацией в сыворотке IL-4: на 10-е сутки – сильная отрицательная связь, на 20-е сутки – умеренная отрицательная связь (табл. 2).

В условиях внутрибрюшинного применения МТ при ТТ на 10-е и 20-е сутки увеличиваются скорость эпителизации раны (табл. 1). В динамике эксперимента скорость эпителизации на 10-е и 20-е сутки выше (р < 0,01), чем на 5-е сутки, на 20-е сутки выше (р < 0,01), чем на 5-е и 10-е сутки.

Внутрибрюшинное применение МТ при ТТ снижает концентрацию в сыворотке TNFα на 10-е и 20-е сутки, концентрация IL-4 не имеет значимых изменений (табл. 1). Во все сроки наблюдения концентрация TNFα и IL-4 в сыворотке была выше (р < 0,01), чем в группе интактных животных. В динамике ТТ концентрация TNFα не изменяется, концентрация IL-4 на 10-е сутки выше (р < 0,01), чем на 5-е сутки.

Корреляционный анализ позволил выявить взаимосвязи между скоростью эпителизации раны и концентрацией в сыворотке TNFα: на 5-е сутки – умеренная положительная связь, на 10-е и 20-е сутки умеренная отрицательная связь (табл. 2).

Обсуждение

При ТТ повышение концентрации TNFα в сыворотке связано с синдромом гиперметаболизма, в том числе генерацией АФК, катаболизмом липидов и высвобождением свободных жирных кислот, разобщением окисления и фосфорилирования [1]. Низкий уровень TNFα в сыворотке связывают с хорошим прогнозом при ТТ [1]. Наряду с изменением соотношения Th1/Th2-зависимого ответа, при ТТ имеет значение активация Th17, в том числе IL-4, в частности это приводит к ухудшению репарации и риску ожогового сепсиса [2].

Зафиксированная взаимосвязь между скоростью эпителизации раны с концентрацией в сыворотке TNFα и IL-4 объясняется тем, что в первые 5 суток, когда преобладают альтеративные (вторичная альтерация) и сосудисто-экссудативные, лейкоцитарные реакции, дегрануляция тучных клеток и высвобождение преформированных медиаторов (гистамина, TNFα, IL-1β, IL-6, IL-4 и др.) приводит к артериальной и венозной гиперемии, экссудации, активации фагоцитов [3]. Далее на 10-20-е сутки увеличивается синтез коллагена, что в том числе связано с активацией химазой мастоцитов сигнального пути TGF-β1/Smads и пролиферацией фибробластов, увеличение синтеза серотонина, что повышает выживаемость и миграцию фибробластов и кератиноцитов, участвуя таким образом в регуляции заживления ожоговой раны, а применение блокаторов высвобождения эндогенного серотонина приводит к замедлению эпителизации.

При сравнении при ТТ эффектов локального применения МТ в отличие от внутрибрюшинного применения МТ выявлено, что на 5-е, 10-е и 20-е сутки более выраженное увеличение скорости эпителизации, а также зафиксирована более низкая концентрация в сыворотке TNFα и IL-4 на 5-е сутки наблюдения.

Полученный протекторный, ускоряющий заживление эффект МТ в очаге ТТ обусловлен мультитропными свойствами и обеспечивается несколькими механизмами. Во-первых, известное антиоксидантное действие МТ, за счет снижения выраженности вторичной альтерации в очаге повреждения кожи, активацию и продукцию медиаторов, прежде всего провоспалительных цитокинов. Антиоксидантный эффект МТ и защита клеток от окислительного повреждения повышает целостность микросомальной мембраны и уменьшает утечку гидролаз в цитозоль и межклеточное пространство [4]. Уменьшается активация циркулирующих в крови фагоцитов, в том числе поглотительная и НСТ-редуцирующая активности нейтрофилов; снижается гибель лимфоцитов при TNFα-опосредованном апоптозе [6]. Падение концентрации в крови TNFα, и др. цитокинов ограничивают синтез в гепатоцитах реактантов острой фазы, в том числе C-РБ.

Во-вторых, противовоспалительное действие МТ связывают с ограничением NF-κB-зависимых путей сигнализации. МТ ингибирует экспрессию iNOS, циклооксигеназы (ЦОГ)-2, TNFα, NLRP3-зависимый путь сигнализации, активируемый при окислительном повреждении митохондрий и связанный с экспрессией IL-1β и IL-18, проапоптогенных факторов [7]. Посредником противовоспалительного действия МТ выступает сиртуин SIRT1, подавляющий активацию NF-κB-, NLRP3-зависимых путей. МТ изменяет фенотип макрофагов в сторону преобладания М2 субпопуляции с противовоспалительным потенциалом.

В-третьих, протекторное действие МТ в очаге ТТ обусловлено его антиапоптогенным эффектом: опосредованно через снижение активации клеток-продуцентов TNFα, снижение экспрессии проапоптических белков в кератиноцитах за счет уменьшения выхода цитохрома C из митохондрий, подавления активации каспаз-9, 3 и 7 [8]. Это продемонстрировано в кератиноцитах линии HaCaT с помощью TUNEL-теста. МТ подавляет апоптоз и аутофагию в кардиомиоцитах при ишемическом повреждении через активацию NAD-зависимого гистона SIRT1.

Проведенный нами корреляционный анализ, позволил выявить, что при ТТ в условиях применения ДП с МТ более сильные связи, чем в условиях применения МТ внутрибрюшинно, а значит быстрее проходят процессы репарации, снижается площадь альтерации и уменьшается синтез цитокинов в сыворотке.

Выводы

1. При ТТ на 5-е, 10-е и 20-е сутки в сыворотке увеличивается концентрация TNFα и IL-4. На 10-е и 20-е сутки зафиксированы умеренные положительные связи между скоростью эпителизации раны и концентрацией цитокинов в сыворотке.
2. Внутрибрюшинное применение МТ при ТТ на 5-е, 10-е и 20-е сутки увеличивается скорость эпителизации, на 10-е и 20-е сутки снижается концентрация TNFα. На 5-е, 10-е и 20-е сутки зафиксированы умеренные отрицательные связи между скоростью эпителизации раны и концентрацией TNFα.
3. В условиях применения ДП с МТ при ТТ на 5-е, 10-е и 20-е сутки увеличивается скорость эпителизации раны, в сыворотке снижается концентрация TNFα, концентрация IL-4 снижается на 10-е сутки. На 5-е, 10-е и 20-е сутки зафиксированы отрицательные связи между скоростью эпителизации раны и концентрацией в сыворотке TNFα и IL-4.
4. Сравнительный анализ эффективности применения ДП с МТ в отличие от внутрибрюшинного применения МТ при ТТ выявил более ускоренную эпителизацию раны и раннее снижение TNFα, больше количество и силы взаимосвязей между скоростью эпителизации раны и концентрацией цитокинов в сыворотке.

About the authors

Michael V. Osikov

South Ural State Medical University; Chelyabinsk Regional Clinical Hospital

Email: ritkaboyko@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Pathophysiology, South Ural State Medical University; Head, Department of Scientific Work, Chelyabinsk Regional Clinical Hospital, Chelyabinsk, Russia

Russian Federation, Chelyabinsk; Chelyabinsk

Anna A. Ageeva

South Ural State Medical University

Email: ri-tochka9@list.ru

Assistant Professor, Department of Pathophysiology, South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russian Federation

Russian Federation, Chelyabinsk

Margarita S. Boyko

South Ural State Medical University

Author for correspondence.
Email: ritkaboyko@yandex.ru

Assistant Professor, Department of Pathophysiology, South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russian Federation

Russian Federation, Chelyabinsk

Yuriy I. Ageev

South Ural State Medical University

Email: ri-tochka9@list.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Pathophysiology, South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russian Federation

Russian Federation, Chelyabinsk

References

Supplementary files