Flow cytometry analysis of PD1 expression on rat blood CD3⁺ lymphocytes stimulated by CD3 antibodies

Full Text

Введение

PD-1 – молекула запрограммированной гибели 1 – экспрессируется Т-лимфоцитами во время активации и действует как естественный тормоз для сдерживания гиперактивации T-лимфоцитов [6]. Ингибирующий рецептор PD-1 был назван «иммунным контрольным пунктом» в связи с его ролью в качестве привратника иммунных реакций [4]. В сигнальном пути PD-1 было обнаружено два лиганда: PD-L1 и PD-L2. Взаимодействие PD-1 с PD-L1 и PD-L2 вызывает функциональное истощение Т-клеток за счет ослабления пролиферации Т-клеток, продукции цитокинов и снижения выживаемости Т-клеток [1]. Считается, что через путь PD-1 осуществляется негативная регуляция иммунной системы, поддерживающая периферическую толерантность и защищающая ткани от аутоиммунной атаки [2]. PD-L1, экспрессируемые на опухолевых клетках, взаимодействуют с PD-1 на атакующих их Т-клетках, что предотвращает их активацию и способствует индукции иммунной толерантности к опухоли [1].

Роль PD1/PD-L пути в функционировании Т-лимфоцитов человека исследуют в экспериментах in vivo и in vitro. Известно, что индуцировать экспрессию PD-1 в T-лимфоцитах человека in vitro можно стимуляцией антителами к CD3 и антителами к СD28 [5]. Так, Thaventhiran и соавт. показали, что инкубация изолированных CD4⁺Т-клеток памяти человека в присутствии иммобилизованных в лунках планшета антител клона NIB1412, специфичных к эпсилон субъединице CD3 человека, приводит к повышению числа PD-1 экспрессирующих клеток уже в первый день инкубации с максимумом на третий день [7].

В ряде случаев работа с использованием материалов человека ограничена, тогда исследования проводят на лабораторных животных. Мало известно об экспрессии PD-1 у крыс и возможности индукции экспрессии PD-1 in vitro и in vivo. Для индукции PD-1 на лимфоцитах крыс в настоящем исследовании мы апробировали антитела к CD3 клона G4.18. Показано, что данные антитела вызывают ингибирование аллогенных реакций в смешанной культуре лимфоцитов, блокируют цитотоксичность клеток, полученных от крыс с развившейся реакцией отторжения трансплантата [3]. В in vivo экспериментах показано, что терапия крыс антителами клона G4.18 индуцирует долгосрочную специфическую толерантность к аллотрансплантату органа [3], и способствует снижению тяжести и ускорению выздоровления от экспериментального аллергического энцефаломиелита путем блокирования функций эффекторных Th1-клеток [8]. Возможно, иммуносупрессивный эффект антител к CD3 клона G4.18 опосредован через сигнальный PD-1/PD-L путь. Однако вызывают ли антитела к CD3 клона G4.18 индукцию экспрессии PD-1 на лимфоцитах не известно.

Цель работы – исследовать влияние антител к CD3 клона G4.18 на экспрессию PD-1 на Т-лимфоцитах in vitro у крыс Wistar.

Материалы и методы

Лимфоциты выделяли из свежей крови 13 интактных крыс Wistar (Питомник лабораторных животных «Рапполово») центрифугированием в растворе фиколла, 400g, 30 минут. 1 млн лимфоцитов крови крыс в 1 мл полной питательной среды (ППС), содержащей среду RPMI-1640 («ПанЭко»), 50 Ед/мл пенициллина («ПанЭко»), 0,05 мг/мл стрептомицина («ПанЭко») культивировали 2,5 суток при 37 °С, 5% СО₂ в 24-луночном планшете с предварительно засорбированными на дне лунок антителами к CD3 клона G4.18 (Anti-Rat CD3 SAFIRE Purified, MBS696583, MyBioSource, США). Для сорбции антител, 500 мкл раствора антител в ЗФР с С = 5 мкг/мл инкубировали 2 часа при 37 °С, затем дважды отмывали ЗФР и один раз питательной средой RPMI-1640. После культивирования клетки извлекали из лунок, центрифугировали и измеряли популяции клеток на проточном цитометрии CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter (предоставлен Центром коллективного пользования приборами ФГБОУ ВО УдГУ) с использованием антител к CD3 крысы, меченных FITC, антител к PD-1 крысы, меченных APC (MyBioSource, США). Статистический анализ проводили с помощью ANOVA, GraphPad Prism 8.4.3. Отличия считали значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Типичная картина распределения клеток по параметрам бокового и прямого светорассеяния, выявленная до культивирования, после 2,5 дней культивирования без антител и в присутствии антител к CD3 клона G4.18 представлена на рисунке 1 А-В (см. 2-ю стр. обложки). Область I по параметрам прямого и бокового светорассеяния соответствует интакным лимфоцитам крыс. Как видно на рисунке 1А (см. 2-ю стр. обложки), большая часть интактных лимфоцитов крови, изолированных на фиколле, локализуются в области I. После 2,5-дневного инкубирования клеток в питательной среде без антител к CD3 большая часть клеток остается в той же области I (рис. 1Б, см. 2-ю стр. обложки). Клетки, культивированные 2,5 дня в присутствии антител к CD3, локализуются в области II, т. е. характеризуются относительно большей величиной бокового светорассеяния и малой величиной прямого светорассеяния, что указывает на уменьшение размеров клеток и усложнение их внутренней структуры под действием антител к CD3 (рис. 1В, см. 2-ю стр. обложки; табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. Процентное количество лимфоцитов и их субпопуляций до культивирования и после 2,5 дневного культивирования в присутствии иммобилизованных антител к CD3 клона G4.18 и без них, среднее ±S D, n = 13

TABLE 1. Percentage of lymphocytes and lymphocyte subpopulations before cultivation and after 2.5 days of cultivation in the presence of immobilized G4.18 anti-CD3 antibodies and without them, mean ± SD, n = 13

% клеток Percentage of cells	Интактные лимфоциты Intact lymphocytes	Лимфоциты, инкубированные в ППС Lymphocytes incubated in a complete culture medium	Лимфоциты, инкубированные в присутствии антител к CD3 Lymphocytes incubated in the presence of anti-CD3 antibodies
Лимфоциты от области I Lymphocytes from gate I	47,60±17,43	37,69±15,63	9,48±11,41**
Лимфоциты от области II Lymphocytes from gate II	7,37±2,47	35,04±8,44*	56,22±12,45**
CD3+ лимфоциты от области I CD3+ lymphocytes from gate I	66,60±7,86	69,99±8,02	25,08±19,63**
CD3+ лимфоциты от области II CD3+ lymphocytes from gate II	14,13±10,03	44,99±9,24*	23,04±8,97**
PD-1+ лимфоциты среди CD3 лимфоцитов области I PD-1+ lymphocytes from CD3 lymphocytes of gate I	0,24±0,19	0,32±0,26	0,64±0,76
PD-1+ лимфоциты среди CD3 лимфоцитов области II PD-1+ lymphocytes from CD3 lymphocytes of gate II	2,60±2,62	4,59±5,81	12,05±6,04**

Примечание.

* – достоверно, по сравнению с данными интактных лимфоцитов (p < 0,01, ANOVA),

** – достоверно, по сравнению с данными двух других групп (p < 0,01, ANOVA).

Note. *, significantly, compared with the data of intact lymphocytes (p < 0,01, ANOVA); **, significantly, compared with the data of the other two groups (p < 0.01, ANOVA).

 

Таким образом, стимуляция лимфоцитов крови крыс иммобилизованными на пластике антителами к CD3 клона G4.18 вызывает изменение их морфологии. Возможно, это связано с инициацией в этих клетках апоптоза, т. к. известно, что по мере развития апоптоза клетки уменьшаются в размерах.

Процент CD3⁺ лимфоцитов от области I после инкубирования в ППС остается прежним, в то время как культивирование в присутствии антител к CD3 ведет к достоверному уменьшению процента CD3⁺ лимфоцитов в области I и достоверному увеличению доли CD3⁺ лимфоцитов от области II относительно исходного количества CD3⁺ клеток в этой области, более значительному, чем увеличение доли CD3⁺ лимфоцитов, инкубированных в ППС, доля которых в области II тоже достоверно увеличивается (табл. 1).

Исследование экспонирования PD-1 на мембране лимфоцитов показало, что в области I PD-1⁺CD3⁺ лимфоциты отсутствуют (табл. 1). PD-1⁺ лимфоциты найдены в области II (табл. 1). В области II доля PD-1⁺ лимфоцитов среди CD3⁺ лимфоцитов достоверно выше в образцах лимфоцитов, инкубированных в присутствии антител к CD3, чем в образцах, инкубированных в ППС без антител (табл. 1; рис. 1). Таким образом, антитела к CD3 клона G4.18 индуцируют экспрессию PD1⁺ в CD3⁺ лимфоцитах и вызывают изменение их морфологии.

 

Рисунок 1. Репрезентативные диаграммы распределения лимфоцитов периферической крови крыс по параметрам прямого и бокового светорассеяния клеток перед культивированием (А), после 2,5-дневного инкубирования в питательной среде (Б) и после 2,5-дневного культивирования с иммобилизованными на дне лунок антителами к CD3 (В). Г – пример диаграммы для определения процента PD1⁺ клеток среди CD3⁺Т-лимфоцитов

Figure 1. Representative forward and side scatter plot of rat peripheral blood lymphocytes before cultivation (A), after 2,5 days of cultivation in a culture medium (B) and after 2,5 days of cultivation with anti-CD3 antibodies immobilized at the bottom of the wells (C). D is an example of a plot for determining the percentage of PD1⁺ cells among CD3⁺T lymphocytes

 

Выводы

Культивирование лимфоцитов крови крыс Wistar в присутствии иммобилизованных в лунках планшета антител к CD3 клона G4.18 приводит к увеличению числа PD1⁺ экспрессирующих клеток среди Т-лимфоцитов и изменению их морфологии.

About the authors

Tatyana V. Khramova

Udmurt State University; Udmurt Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: khratat@mail.ru

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Molecular and Cell Immunology, Research Associate, Laboratory of Biocompatible Materials

Russian Federation, 1 Universitetskaya St., Izhevsk, Udmurtia, 426034; 34, st. them. Tatyana Baramzina, Izhevsk, 426067

Liubov V. Beduleva

Udmurt State University; Udmurt Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: lvbeduleva@gmail.com

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Chief Research Associate, Laboratory of Molecular and Cell Immunology, Leading Research Associate, Laboratory of Biocompatible Materials

Russian Federation, 1 Universitetskaya St., Izhevsk, Udmurtia, 426034; 34, st. them. Tatyana Baramzina, Izhevsk, 426067

Kseniya V. Fomina

Udmurt State University; Udmurt Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: fomiksa@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Molecular and Cell Immunology, Senior Researcher, Laboratory of Biocompatible Materials

Russian Federation, 1 Universitetskaya St., Izhevsk, Udmurtia, 426034; 34, st. them. Tatyana Baramzina, Izhevsk, 426067

Nadezhda N. Abisheva

Udmurt State University; Udmurt Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: naidik84@mail.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Molecular and Cell Immunology, Researcher, Laboratory of Biocompatible Materials

Russian Federation, 1 Universitetskaya St., Izhevsk, Udmurtia, 426034; 34, st. them. Tatyana Baramzina, Izhevsk, 426067

References

Supplementary files