Immunopharmacological aspects of studying immunotropic properties of a novel biocompound

Full Text

Введение

Практическое здравоохранение нуждается в поиске новых эффективных лечебно-профилактических средств в области гастроэнтерологии и иммунологии [1, 3, 4]. На сегодняшний день, одной из актуальных и востребованных фармакологических групп, применяемых при заболеваниях печени и желчевыводящих путей являются гепатопротекторные препараты. Поисковые исследования большинства отечественных и зарубежных авторов свидетельствуют, что в создании подобных препаратов фармакологический приоритет целесообразно отдавать медицинским иммунобиологическим препаратам микробного происхождения с иммунотропной активностью. В связи с этим весьма актуальной является группа пробиотических препаратов, а, в частности, лекарственные кандидаты нового поколения – метабиотики. Так, известно, что в основа метабиотиков представлена биологически активными веществами (БАВ), продуцируемыми пробиотическими микроорганизмами. С точки зрения современной фармакологии и биотехнологии наиболее востребованными продуцентами БАВ являют непатогенные микроорганизмы рода Bacillus, которые на сегодняшний день расцениваются как самоэлиминирующиеся антагонисты. Наиболее актуальным в этом плане представляется штамм Bacillus subtilis, который обладает значимой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и не чувствительны или малочувствительны к современным химиотерапевтическим препаратам [2, 5, 8]. Автором был получен, выделен, изучен и депонирован штамм ВКПМ Bacillus subtilis В-9909, который в более ранних исследованиях проявил гепатопротекторную активность, а также иммунотропное действие в отношении гуморального звена иммунитета.

В связи с этим значительный научный интерес представляют метабиотик, полученный на основе БАВ штамм ВКПМ Bacillus subtilis В-9909.

Цель исследования – экспериментальная оценка иммунотропного действия метаболитов, продуцируемых пробиотическими микроорганизмами штамма ВКПМ Bacillus subtilis В-9909 на лабораторных животных при моделировании у них токсического поражения печени.

Материалы и методы

В работе использовали биологически активные вещества (метаболиты) микроорганизмов штамма ВКПМ Bacillus subtilis В-9909.

Комплекс биологически активных веществ получали в лабораторных условиях по имеющимся в настоящее время в научной литературе рекомендациям [3, 4, 6, 7].

Метаболиты выделяли из культуральной жидкости бактериальной культуры Bacillus subtilis, штамм ВКПМ В-9909, при его глубинном культивировании в среде, состоящей из соляно-кислотного гидролизата соевой муки или панкреатического гидролизата казеина. Культура в это время находилась в конце экспоненциальной фазы роста (16-18 часов культивирования) [3, 7].

Культивирование проводили в 250,0 мл колбах на термостатированной установке выращивания микроорганизмов УВМТ-12-250. Для получения культуральной жидкости в больших объемах использовали ферментер БИОР-0,1.

В последующем культуральную жидкость подвергали следующим технологическим операциям:

• – центрифугированию (8000 об/мин в течение 15 минут) или при больших объемах культуральной жидкости сепарированию (для отделения клеточной массы) с использованием сепаратора АСГ-3МБ;
• – ультразвуковой дезинтеграции (для разрушения оставшихся бактериальных клеток Bacillus subtilis) для чего использовали ультразвуковой диспергатор УЗД2-0,1/22 [2, 6, 7];
• – стерилизующей ультрафильтрации с использованием мембранных фильтров Millipor с диаметром пор 0,22 мкм и Sartorius с диаметром пор 0,3 мкм;
• – лиофильному высушиванию (до уровня остаточной влажности 3-5%) на лабораторной установке сублимационной сушки ЛСС-2. Выход лиофильно высушенного комплекса БАВ, освобожденного от клеточной биомассы (из 1 л фугатной жидкости), составлял – 10-15 г.

Качественное и количественное содержание метаболитов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разделение проводили при комнатной температуре с использованием колонки Supelcosil^TM LC-18 (250 × 4,6 мм, размер частиц 5 мкм).

Поражение печени у белых лабораторных крыс изучали путем моделирования острого токсического гепатита.

Экспериментальный токсический гепатит моделировали путем внутрижелудочного введения 40%-ного раствора CCl₄ в вазелиновом масле в течение 2 недель из расчета 0,2 г/кг.

В исследовании было выделено четыре исследуемые группы по 12 лабораторных крыс в каждой:

1. – группа животных, которым назначили исследуемый метабиотик;
2. – группа животных, которым назначили препарат сравнения урсосан;
3. – контроль (без лечения);
4. – контроль интактные.

Для оценки показателей клеточного иммунного статуса у лабораторных животных при применении экспериментального образца метаболитов в условиях моделирования острого токсического гепатита исследовали следующие показатели:

• – количественное определение фагоцитарной активности (ФА) нейтрофилов периферической крови, опт. ед.;
• – определение метаболической активности нейтрофилов периферической крови в НСТ-тесте, опт. ед;
• – количественное определение Т- и В- лимфоцитов методом Е-розетко-образования, 10⁶/см³;
• – количество антителообразующих клеток (АОК), 10⁶/см³.

Результаты статистически анализировались с использованием пакетов компьютерных программ Microsoft Office Excel 2010 и Statistica 12.0. При этом был использован метод дисперсионного анализа (ANOVA). Оценивали нормальность распределения полученных данных по методу Колмогорова–Смирнова. Статистическую оценку достоверности межгрупповых различий проводили с использованием параметрического критерия Фишера в зависимости от нормальности распределения данных. Оценку статистических гипотез выполняли при критическом уровне значимости р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Полученные экспериментальные данные изменения показателей клеточных факторов иммунитета белых лабораторных крыс при моделировании острого токсического гепатита свидетельствуют о том, что на 3-и сутки эксперимента в группе IV подопытных животных с воспроизведенной моделью острого токсического гепатита, по сравнению с III (контрольной) группой животных, отмечается существенное повышение всех изучаемых показателей клеточных факторов иммунитета. Так, фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови возросла более, чем в 4 раза – 65,2±0,48 опт. ед., поглотительная способность нейтрофилов в НСТ-тесте увеличилась в 2,5 раза – 0,09±0,02 опт. ед., увеличилось количество Т- и В-лимфоцитов в 2 раза – 0,43±0,05 × 10⁶/см³ и 0,35±0,04 × 10⁶/см³, количество АОК в 2,4 раза – 0,153±0,021 × 10⁶/см³, соответственно.

В I и II группах подопытных животных, получавших экспериментальный образец метабиотика и препарат сравнения урсосан, по сравнению с III (контрольной), отмечается более выраженное увеличение всех изучаемых клеточных факторов иммунитета – повышение фагоцитарной активности нейтрофилов крови в 5,2 и 4,6 раза, поглотительной способности нейтрофилов в НСТ-тесте в 8 и 6 раз, увеличение количества Т- и В-лимфоцитов в 2,3 и 2,1 раз, а также увеличение количества АОК в 1,5 раза в обеих группах соответственно.

Кроме того, на 8-е сутки эксперимента наблюдалось увеличение количества АОК и, соответственно, Т- и В-лимфоцитов. Фагоцитарная активность и поглотительная способность нейтрофилов крови оставалась на прежнем уровне.

На 14-е и 28-е сутки наблюдения отмечали положительную динамику изменения показателей клеточного иммунитета, в большей степени выраженную в I группе подопытных животных, получавших экспериментальный образец метабиотика, чем во II группе подопытных животных, которым вводили препарат сравнения урсосан.

Заключение

Полученные экспериментальные данные показателей факторов клеточного иммунитета позволяют судить об активации фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови в ранние сроки эксперимента, что подтверждается данными, полученными в НСТ-тесте. Одновременно, в ранние сроки эксперимента значительно выросло количественное представление популяций Т- и В-лимфоцитов, а также количество АОК, что говорит об активации всех звеньев клеточного иммунитета, в ответ на токсическое воздействие четыреххлористого углерода.

Таким образом, проведенные исследования по изучению клеточного статуса лабораторных животных, получавших метаболиты, продуцируемых пробиотическими микроорганизмами рода Bacillus при моделировании у них токсического поражения, дают основания выполнить заключение о наличии у испытуемого образца метабиотика (БАВ) существенного иммуномодулирующего эффекта, в сравнении с урсосаном.

About the authors

Nikolay A. Zabokritskiy

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: pharmusma@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-4661-5732

MD, Associate Professor, Senior Researcher of the laboratory of immunophysiology and immunopharmacology

Russian Federation, 106 Pervomaiskaya St., Yekaterinburg 620049

References

Supplementary files