Significane of determining antinuclear antibodies in systemic connective tissue disorders in children

Anastasia A. Zhuzhula; Жужула Анастасия Андреевна; Olga V. Kurbatova; Курбатова Ольга Владимировна; Marina A. Snovskaya; Сновская Марина Андреевна; Svetlana V. Petrichuk; Петричук Светлана Валентиновна; Tatiana M. Komyagina; Комягина Татьяна Михайловна; Anastasia S. Tryapochkina; Тряпочкина Анастасия Станиславовна

doi:10.46235/1028-7221-9961-SOD

Significane of determining antinuclear antibodies in systemic connective tissue disorders in children

Authors: Zhuzhula A.A.¹, Kurbatova O.V.¹, Snovskaya M.A.¹, Petrichuk S.V.¹, Komyagina T.M.¹, Tryapochkina A.S.¹
Affiliations:
1. National Medical Research Center for Children’s Health
Issue: Vol 26, No 3 (2023)
Pages: 251-258
Section: SHORT COMMUNICATIONS
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/9961
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-9961-SOD
ID: 9961

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Systemic connective tissue diseases (SCTD) are characterized by systemic autoimmune inflammation and are accompanied by development of antinuclear antibodies (ANA). Our aim was a comparative analysis of ANA in blood serum in children with systemic lupus erythematosus (SLE) and rheumatoid arthritis (RA). The study included 50 patients with SLE, 50 patients with RA who were treated at the National Medical Research Center of Children’s Health. Median age was 12,2 y. o. (9-15.5). The titers of ANA and the cell fluorescence type were determined with the indirect immunofluorescence reaction (IFR) using the HEp-2 cell line (Immco Diagnostics, Inc, USA), as well as the concentration of antibodies to double-stranded DNA (adsDNA) in blood serum samples of the children detected by immunochemiluminescence (ICM) woth Elia™ dsDNA (Thermo Fisher Scientific, USA). A positive ANA titer and adsDNA were found, respectively, in 98% and in 48% in children with SLE. A positive ANA titer and adsDNA was detected in 100% and in 4% of children with RA, respectively. Highly positive ANA titers (> 1/1280) have been detected in 68% of children with SLE, and in 30% of children with RA. None of the RA patients with highly positive ANA titers had adsDNA. But, in patients with SLE, highly positive ANA titers and a positive dsDNA level were simultaneously detected in 16% of cases. There are both single types of cell fluorescence and their combinations in children with SLE and RA. Nuclear dot-like fluorescence was more common in children with SLE, cytoplasmic type, in children with RA, nucleolar type of glow was found only in children with RA. The revealed combinations of ANA and adsDNA titers in children with SLE and RA confirm the need for simultaneous use of RNIF and ICM.

Keywords

children, systemic lupus erythematosus, arthritis, antinuclear antibodies, dsDNA, HEp-2, immunofluorescence, immunochemiluminescence

Full Text

Введение

Системные поражения соединительной ткани (СПСТ) – это группа заболеваний с системным аутоиммунным воспалительным поражением соединительной ткани и ее производных, сопровождающееся появлением аутоагрессивных антинуклеарных антител (АНА) [3, 6, 10]. Наиболее распространенными СПСТ являются системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит (РА) [3, 12].

СКВ – это системное аутоиммунное заболевание соединительной ткани неизвестной этиологии, характеризующееся генетически обусловленным нарушением иммунной регуляции, образованием аутоагрессивных АНА и воспалительным поражением тканей органов [4, 8]. СКВ редко встречается у детей младше 5 лет, подъем заболеваемости регистрируется с 8-9 лет, а пик отмечается в возрасте 14-25 лет (средний возраст дебюта заболевания – 11-12 лет), чаще всего это заболевание выявляется у детей женского пола [4, 8]. РА – мультифакторное наследственное заболевание, характеризующееся системным воспалением соединительной ткани с поражением суставов, относящееся к самым инвалидизирующим ревматическим заболеваниям [5]. Дебют РА приходится на возраст до 16 лет, чаще болеют девочки [5].

АНА представляют собой гетерогенную группу аутоагрессивных антител, которые вырабатываются к различным компонентам ядра и цитоплазмы клеток [1, 13]. Определение их концентрации в сыворотке крови пациентов играет важную роль в диагностике СПСТ [6, 13].

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) на клеточной линии HEp-2 является «золотым стандартом» и главным скрининговым методом лабораторной диагностики СПСТ для выявления АНА в сыворотке крови [1, 3]. Этот метод используют для ранней диагностики СПСТ, а также для исключения диагноза «СПСТ» при схожей клинической картине других заболеваний, таких как СКВ, РА, системные васкулиты и т. д. [6]. Результат АНА представляет собой информацию о конечном титре АНА и типе свечения ядра и цитоплазмы [13]. На тип свечения АНА влияют аутоантитела, которые реагируют с антигенами в ядре и цитоплазме клеток HEp- 2. Чаще всего определяют следующие типы свечения: гомогенный, гранулярный, смешанный (гомогенный + гранулярный), точки в ядре, центромерный, ядрышковый и цитоплазматический [13].

Иммунохемилюминисцентный анализ (ИХЛА) методом Elia™ dsDNA – один из самых точных существующих лабораторных методов для определения концентрации IgG к дсДНК и обнаружения комплекса антиген-антитело.

В связи с возможностью развития СПСТ в детском возрасте, является актуальным раннее выявление маркеров данных заболеваний для своевременного назначения патогенетического лечения. Так, по данным литературы, выявление АНА у детей с олигоартритом в раннем возрасте может указывать на риск развития увеита [2, 9]. Однако АНА не специфичны для РА [9]. При СКВ роль АНА в проявлениях заболевания лучше изучена, особенно в отношении адсДНК. Показано, что эти антитела могут способствовать развитию нефрита путем образования иммунных комплексов, которые откладываются в почках [7, 11].

Лабораторная диагностика ревматических болезней с помощью АНА и адсДНК подробно изучены у взрослых [6]. Анализ использования АНА в педиатрической практике представлен единичными публикациями [9].

Цель исследования – провести сравнительный анализ АНА в сыворотке крови у детей при системной красной волчанке (СКВ) и ревматоидном артрите (РА).

Материалы и методы

В исследовании было включено 100 детей с СПСТ, которые проходили обследование и лечение в ФГАУ «НМИЦ здоровья детей» Минздрава России, 50 пациентов с СКВ, 50 пациентов с РА. Me возраста = 12,2 (9-15,5) года.

В рамках обследования всем детям проводили определение АНА на клеточной линии HEp-2 с помощью РНИФ (Immco Diagnostics, Inc., США) и определение концентрации адсДНК в сыворотке крови с помощью ИХЛА методом Elia™ dsDNA (Thermo Fisher Scientific, США).

В методе РНИФ использовали клеточную линию HEp-2 (эпителиальные клетки аденокарциномы гортани человека), которую инкубировали с сыворотками крови пациентов в серийных разведениях в лунках предметного стекла. После отмывки от не связавшихся компонентов в лунки предметного стекла вносили FITC конъюгат. Результат реакции оценивали с помощью флюоресцентного микроскопа Nikon Eclipse Ni (Япония) при 40× увеличении. Учитывали максимальный титр обнаружения АНА и тип свечения клеток. Нормальными значениями считали титры АНА < 1/160, при титре 1/160 ответ считали низкопозитивным, 1/320-1/640 – умеренно позитивным, 1/1280 и выше – высокопозитивным [1].

Определение адсДНК проводили методом Elia™ dsDNA, в основу которого положена технология Sandwich-метода: антитела исследуемой биологической жидкости реагируют с иммобилизированными на твердой фазе антигенами, образуя комплекс. При определении IgG к дсДНК методом Elia™ результат считали отрицательным, если концентрация аналита < 10 кЕ/л, сомнительным – 10-14,9 кЕ/л, положительным – > 15 кЕ/л.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Statistica 10.0 (StatSoft, США), Excel (Microsoft, США), IBM SPSS Statistics 25 (США). Описательная статистика количественных признаков представлена в формате: медиана (нижний и верхний квартили) – Me (Q₀_,₂₅-Q₀_,₇₅).

Результаты и обсуждение

Проведенный анализ полученных результатов обследования детей с СКВ выявил: позитивный титр АНА обнаружен у 98% пациентов, из них титр 1/160 – у 2% детей (низкопозитивный), 1/320 – у 18% пациентов (умеренно позитивный), 1/640 – у 10% детей (умеренно позитивный), 1/1280 – у 30% пациентов (высокопозитивный), 1/2560 – у 28% детей (высокопозитивный), 1/5120 – у 10% пациентов (высокопозитивный). У 2% детей с СКВ титр АНА был < 1/160 (табл. 1).

У 48% детей с диагнозом «СКВ» обнаружены адсДНК, у 8% детей уровень адсДНК находится в «серой зоне», у 44% уровень адсДНК не обнаружен. У всех детей с позитивным уровнем адсДНК титр АНА в РНИФ был выше диагностического порога 1/160. У 2% детей при сомнительном результате адсДНК не выявлено флюоресцентного свечения при проведении РНИФ. Проводя оценку интенсивности титров в РНИФ и определение адсДНК, нами обнаружено: дети с низкопозитивным титром АНА (2%) имели положительный результат адсДНК – в 2% случаев. Пациенты с умеренно позитивным титром АНА (28%) имели положительный результат адсДНК – в 14%, сомнительный результат – в 4%, отрицательный результат – в 10%. Дети с высокопозитивным титром АНА (68%), результат адсДНК был следующий: положительный – у 34%, сомнительный – 2%, отрицательный – 34% (табл. 1).

У детей с РА при анализе уровня АНА выявлено, что позитивный титр АНА был у 100%, из них: титр 1/160 – у 2% детей (низкопозитивный), 1/320 – у 38% пациентов (умеренно позитивный), 1/640 – у 30% детей (умеренно позитивный), 1/1280 – у 20% пациентов (высокопозитивный), 1/2560 – у 10% детей (высокопозитивный). Только у 4% детей с диагнозом «РА» были выявлены адсДНК, у 6% детей уровень адсДНК находился в «серой зоне», у 90% детей – адсДНК не выявлены. У 4% пациентов, у которых выявлены адсДНК, титр АНА был выше диагностического порога 1/160. Ни у одного пациента с РА с высокопозитивным титром АНА (> 1/1280) не выявлено адсДНК. У пациентов, у которых выявлены позитивный уровень адсДНК титр АНА был 1/160 (2%) и 1/320 (2%), у пациентов с сомнительным уровнем адсДНК титр АНА – 1/640 (6%). Данные представлены в таблице 1.

ТАБЛИЦА 1. Показатели титра ана и адсДНК у детей с СКВ и РА

TABLE 1. Indicators of the titer of ana and dsDNA in children with systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis

Диагноз Diagnosis	Количество детей Number of children	Титр АНА Titer of ANA	адсДНК (Elia™) dsDNA (Elia™)
Диагноз Diagnosis	Количество детей Number of children	Титр АНА Titer of ANA	Отрицательный Negative	Сомнительный “Grey zone”	Положительный Positive
СКВ SLE (n = 50)	1 (2%)	< 1/160	0	1 (2%)	0
	1 (2%)	1/160	0	0	1 (2%)
	9 (18%)	1/320	2 (4%)	1 (2%)	6 (12%)
	5 (10%)	1/640	3 (6%)	1 (2%)	1(2%)
	15 (30%)	1/1280	10 (20%)	1 (2%)	4 (8%)
	14 (28%)	1/2560	6 (12%)	0	8 (16%)
	5 (10%)	1/5120	1 (2%)	0	4 (8%)
Итого Total	50 (100%)		22 (44%)	4 (8%)	24 (48%)
РА RA (n = 50)	0 (0%)	< 1/160	0	0	0
	1 (2%)	1/160	0	0	1 (2%)
	19 (38%)	1/320	18 (36%)	0	1 (2%)
	15 (30%)	1/640	12 (24%)	3 (6%)	0
	10 (20%)	1/1280	10 (20%)	0	0
	5 (10%)	1/2560	5 (10%)	0	0
	0 (0%)	1/5120	0	0	0
Итого Total	50 (100%)		45 (90%)	3 (6%)	2 (4%)

Выявлено, что распределение по титрам АНА у детей с СКВ и РА достоверно отличались по критерию ÷² (p < 0,001).

Чаще всего у пациентов с СКВ и РА выявлялись следующие типы свечения АНА: гомогенный, гранулярный, точки в ядре, ядрышковый, смешанный и цитоплазматический типы свечения, представленные на рисунке 1 (см. 2-ю стр. обложки). Любой из определяемых типов свечений АНА мы принимали за положительный результат.

Рисунок 1. АНА на клеточной линии HEp-2 (Immco Diagnostics, Inc., США)

Примечание. А – гомогенный; Б – гранулярный; В – точки в ядре; Г – ядрышковый; Д – смешанный; Е – цитоплазматические типы свечения, флюоресцентная микроскопия, микроскоп Nikon Eclipse Ni (Япония), при ×40 увеличении.

Figure 1. ANA on the HEp-2 cell substrates (Immco Diagnostics, Inc., USA)

Note. A, homogenous; B, speckled; C, nuclear dots; D, nucleolar; E, homogenous+ speckled; F, cytoplasmic types of luminescence, fluorescence microscopy, Nikon Eclipse Ni microscope (Japan), ×40 magnification.

У детей с СКВ выявлялись следующие типы свечения гомогенный (2%), гранулярный (10%), смешанный (30%), сочетанием двух типов свечения (50%), трех типов свечения (6%), у 2% детей свечение АНА не наблюдалось (рис. 2a). В сочетаниях двух типов свечения наблюдались комбинации: гомогенный + цитоплазматический (2%), смешанный + цитоплазматический (16%), гранулярный + цитоплазматический (12%), гранулярный + точки в ядре (6%), смешанный + точки в ядре (14%) (рис. 2А). В сочетаниях трех типов свечения наблюдались комбинации: смешанный + цитоплазматический + точки в ядре (4%) и гомогенный + цитоплазматический + точки в ядре (2%).

Рисунок 2. Процентное соотношение встречаемости разных типов АНА у детей с СКВ (А), с РА (Б)

Figure 2. Percentage of occurrence of different types of ANA in children with SLE (A), with RA (B)

У детей с РА выявлялись следующие типы свечения: гранулярный (6%), смешанный (40%), сочетание двух типов свечения (46%) и трех типов свечения (8%) (рис. 2Б). В сочетаниях двух типов свечения наблюдались комбинации: гомогенный + цитоплазматический (4%), смешанный + цитоплазматический (24%), гранулярный + цитоплазматический (8%), смешанный + точки в ядре (8%), ядрышковый + цитоплазматический (2%) (рис. 2Б). В сочетаниях трех типов свечения наблюдались комбинации: смешанный + цитоплазматический + точки в ядре (2%) и гомогенный + цитоплазматический + точки в ядре (2%), гранулярный + цитоплазматический + точки в ядре (2%), ядрышковый + цитоплазматический + точки в ядре (2%).

Анализ АНА у детей с СКВ и РА показал как одиночные типы свечения, так и их сочетания. Наиболее часто выявлялись комбинации двух или трех типов свечения: в 56% случаев при СКВ и в 54% – при РА. Наиболее часто встречающийся тип свечения как у детей с СКВ, так при РА был смешанный и составлял 30% случаев при СКВ и 40% – при РА. Гранулярный тип свечения у детей с СКВ выявлен в 10%, а у детей с РА – в 6%. Точки в ядре чаще встречались у детей с СКВ, цитоплазматический тип свечения у детей с РА, ядрышковый тип свечения встречался только у детей с РА.

Нами проведен ROC-анализ для оценки разделительной способности различных титров АНА для разделения пациентов с СКВ и РА. При титре АНА > 1/640 показало хорошее качество разделительной модели (AUC = 0,7, Sp = 72%, p < 0,001).

Таким образом, анализ результатов тестирования пациентов показал, что у 48% детей с СКВ выявлены положительные результаты адсДНК при титре АНА (> 1/160), что соответствует данным Лапина С.В. о том, что адсДНК обнаруживается у 40-70% пациентов с СКВ [6]. Нами обнаружено, что позитивные результаты адсДНК соотносятся с позитивными результатами определения АНА методом РНИФ при СКВ, тогда как такой зависимости у пациентов при РА не выявлено.

Обнаружено, что у детей с РА титр АНА чаще выявлялся умеренно позитивный, тогда, как для детей с СКВ был характерен высокопозитивный титр. Данный факт согласуется с данными Пашниной И.А. о том, что при РА титр АНА у детей умеренный [9]. С нашей точки зрения особый интерес представляют результаты проведенного ROC-анализа для разделения СКВ и РА по титру АНА. Титр 1/640 показал хорошее качество разделительной модели, что может быть использовано врачами для проведения дифференциального анализа.

Интересно отметить, что при СПСТ наиболее часто выявляются комбинации из 2-х и 3-х типов свечения, что может свидетельствовать о многофакторности, гетерогенности иммунных нарушений при СКВ и РА [4, 5, 8]. Известно, что аутоантитела могут образовываться к ядру и цитоплазме клеток, что возможно, ассоциировать с тяжестью заболеваний и требует дальнейших исследований [7].

В нашем исследовании у детей с РА также был выявлен ядрышковый тип свечения, что не считается патогномоничным для пациентов с РА и обычно характерен для пациентов со склеродермией и полимиозитом [13]. В то же время у детей с СКВ чаще, чем у пациентов с РА, выявлялись гранулярный тип свечения и точки в ядре.

Заключение

Определение АНА в диагностике СКВ и РА у детей имеет важное клиническое значение. У детей с СКВ чаще определяется высокий титр АНА при положительных результатах адсДНК, тогда как у детей с РА чаще выявляется умеренный титр АНА, при отсутствии адсДНК. У детей с СКВ и РА обнаруживаются разные сочетания титров АНА и уровня адсДНК, что подтверждает необходимость одновременного использования РНИФ и ИХЛА для лабораторной диагностики этих заболеваний. Проведенный ROC-анализ для разделения СКВ и РА и выявленная граница > 1/640, может использоваться врачами для проведения дифференциального анализа.

About the authors