Studies on the hormone and cytokine producing function of human cumulus cells and its interrelation with fertility in polycystic ovarian syndrome

Full Text

Введение

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) является распространенным эндокринным и метаболическим заболеванием у репродуктивных женщин и характеризуется поликистозом яичников, гиперандрогенией и хронической ановуляцией [1]. Аномальный фолликулогенез считается общей характеристикой СПКЯ. Клинические и биохимические характеристики СПКЯ имеют типичную гетерогенность, но аномальное развитие фолликулов, вызывающее ановуляцию, является основной характеристикой СПКЯ [7]. В физиологично развивающем фолликуле на этапе формирования полости внутри фолликула соматические клетки дифференцируются на два различных функционально и анатомических слоя: клетки выстилающие полость фолликула, ответственные за стероидогенез – клетки муральной гранулезы и кумулюсные клетки (КК), непосредственно контактирующие с ооцитом [2, 6]. КК находятся в тесном контакте с ооцитом, их морфофункциональные свойства влияют на качество яйцеклетки, поскольку отвечают за энергетический метаболизм, поддержку ионов, созревание и защиту женской гаметы, изменения в этих клетках могут нанести вред развитию фолликулов и свидетельствовать о повреждении яйцеклетки [11]. В физиологичных условиях КК будут сопровождать ооцит во время овуляции, при оплодотворении и в течение определенного времени после проникновения сперматозоида в яйцеклетку [2, 5, 6].

Возможность отделение клеток кумулюса от ооцита без нарушения его целостности во время проведения экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), делает возможность изучить клетки в культуре [11]. Применение ЭКО у пациенток с СПКЯ, не всегда дает положительный результат [15]. В настоящее время продолжаются научные дискуссии об уровне прогестерона при СПКЯ и его влиянии на исход беременности [8, 13]. При проведении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) обязательной считается оценка качества ооцитов перед переносом эмбрионов. Ооциты в метафазе II очень хрупкие, неоднократное морфологическое исследование напрямую ухудшает качество и влияет на процесс имплантации эмбриона. Поэтому поиск неинвазивных биомаркеров, характеризующих комплекс кумулюсных клеток и ооцита, весьма актуален и может предопределить улучшение результатов беременности при СПКЯ [13].

 

ТАБЛИЦА 1. Содержание прогестерона и цитокинов в культуральной среде при синдроме поликистозных яичников в разные сутки эксперимента

TABLE 1. Content of progesterone and cytokines in the culture medium in polycystic ovary syndrome on different days of the experiment

Показатель, нг/мл Index, ng/mL	1-е сутки 1st day	3-и сутки 3rd day	7-е сутки 7th day	Значение p Value p
Прогестерон Progesteron	10,09±0,14	82,70±0,43	323,70±5,43	ρ < 0,05, (ρ1-3, 3-7, 1-7 < 0,01)
IL-6	20,40±0,52	32,70±0,43	45,600±0,423	ρ < 0,05; (ρ1-3, 1-7 < 0,05)
IL-10	3,66±0,06	4,57±0,05	6,56±0,07	ρ < 0,05, (ρ1-7 < 0,05)
IFNγ	6,24±0,03	3,26±0,04	1,76±0,01	ρ < 0,05 (ρ1-3, 3-7, 1-7 < 0,05)

Примечание. p – статистическая значимость различий (p < 0,05; p < 0,01 по t-критерию Стьюдента) между показателями у женщин при СПКЯ и у здоровых женщин (p_{1-3, 3-7, 1-7} – где _{1-3, 3-7, 1-7} отличия между сутками в одном показателе в одной культуральной среде).

Note. p, statistical significance of differences (p < 0.05; p < 0.01 according to Student’s t-test) between indicators in women with PCOS and in healthy women (p_{1-3, 3-7,1-7}, where _{1-3, 3-7, 1-7} differences between days in one indicator in one culture medium).

 

ТАБЛИЦА 2. Содержание прогестерона и цитокинов в культуральной среде у здоровых доноров в разные сутки эксперимента

TABLE 2. Content of progesterone and cytokines in the culture medium of healthy donors on different days of the experiment

Показатель, нг/мл Index, ng/mL	1-е сутки 1st day	3-и сутки 3rd day	7-е сутки 7th day	Значение ρ Value ρ
Прогестерон Progesteron	14,50±0,36	110,00±2,12	58,25±0,40	ρ < 0,05; (ρ1-3, 3-7, 1-7 < 0,05)
IL-6	6,34±0,30	16,35±0,34	187,53±0,65	ρ < 0,05; (ρ1-3, 3-7, 1-7 < 0,01)
IL-10	1,74±0,57	2,37±0,79	30,16±0,80	ρ < 0,05; (ρ3-7, 1-7 < 0,01)
IFNγ	3,27±0,04	1,24±0,03	71,91±0,31	ρ < 0,05; (ρ 3-7, 1-7 < 0,01)

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

В исследовании 2012 года представлено доказательство положительного влияния добавления рекомбинантного IL-6 при культивирование in vitro свиных диплоидных партенотов до стадии бластоцисты, в результате увеличивалось количество бластоцист, уменьшался апоптоз, снижалась экспрессия мРНК проапоптического гена Casposa3, увеличивались экспрессии антиапоптотического гена BcI2I1 и Survivin, тем самым повышая жизнеспособность свиных эмбрионов [12]. Эти данные концептуально не противоречат полученными нами результатов (табл. 1, 2). В 2018 г. исследователи на экспериментальной модели животных с индуцированным дегидроэпиандростероном СПКЯ, выявили более низкий уровень IFNγ по сравнению с контрольной группой животных [9]. Также зафиксирован более низкий уровень IFNγ в сыворотке крови женщин с СПКЯ, по сравнению со здоровыми женщинами, выявлено, что IFNγ способствует пролиферации, но ингибирует апоптоз гранулезных клеток яичника [9]. В ранее проведенных исследованиях [3, 4] выявлен более низкий уровень IL-10 у женщин с СПКЯ по сравнению с контрольной группой, при лечении IL-10 подавлялся стероидогенез и экспрессия воспалительных генов, что впоследствии может стать новым подходом к терапии СПКЯ [4]. Исследована роль передачи сигналов TGF-â в регуляции опосредованной гиалуроновой кислотой экспансии кумулюса и овуляции в гранулезо-лютеиновых клетках человека. Молекулярные механизмы, с помощью которых TGF-â регулирует синтез гиалуроновой кислоты в клетках КК, до конца не ясны, но требуют изучения из-за своей значимости [14]. В исследовании 2018 года изучали влияние IL-lâ и TNFá на рост и созревание ооцитов из небольших фолликулов во время созревания in vitro, кумулюс-ооцитарные комплексы культивировали с добавлением IL-lâ и TNFá в течении 48 часов. В результате ооциты, культивируемые с добавлением IL-lâ и TNFá, имели больший диаметр в сравнении с контролем [10]. В ряде исследований [6, 8, 11] доказано, что на исход беременности влияют морфофункциональных свойства КК, которые целесообразно изучать в культуре клеток, что может прояснить механизмы нарушений формирования эмбриона и увеличить процент положительных исходов беременности. Целью исследования было получение первичной культуры КК от здоровых доноров и пациенток с СПКЯ, выявление наиболее значимых отличий в синтезе ключевых цитокинов в монокультурах кумулюсных клеток пациенток и здоровых лиц для прогнозирования результатов экстракорпорального оплодотворения.

Материалы и методы

Проведение исследование одобрено Междисциплинарным этическим комитетом ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (протокол № 9 от 16.05.2022 г.). КК были получены от 11 здоровых доноров (средний возраст 28,6±5,3 года) и 10 пациенток с СПКЯ (средний возраст 29,4±3,3 года), обратившихся в клинику репродукции г. Владивостока и прошедших процедуру ЭКО/ИКСИ. Все пациентки подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. В работе использовали КК, которые стандартно утилизируют после проведения манипуляции отделения от ооцита, они не требуются в дальнейшей процедуре ЭКО/ИКСИ. Клетки получали после проведения трансвагинальной пункции в условиях стерильной операционной в асептических условиях. Стимуляцию яичников проводили перед забором материала по стандартным протоколам ЭКО путем введением рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека и высокоочищенного менопаузального гонадотропина человека в индивидуальных дозах согласно протокола введения антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона. Овуляцию индуцировали резус-хорионическим гонадотропином (рчХГ), чтобы вызвать созревание ооцитов на 9-12-й день после первоначального введения гонадотропина. Забор ооцитов стандартно проводили в клинике репродукции человека с помощью трансвагинального УЗИ через 36 ч после введения рчХГ. Отделение КК от ооцита без нарушения его целостности позволяет использовать обычно утилизируемые КК для дальнейшего исследования, что никак не нарушает права эмбриона.

После забора ооцитов происходит механическое удаление окружающих ооциты соматических клеток – corona radiata и cumulus oophorus. Осаждали центрифугированием при 500 g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Надосадочную жидкость удаляли, осадок клеток ресуспендировали в среде Искова (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium, Gibco, США), содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки, 1 раствор заменимых аминокислот (MEM NEAA, Gibco, США); 1,2 мМ á-тиоглицерола (Sigma-Aldrich, США), 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma-Aldrich), 100 ед/мл пенициллина (Sigma-Aldrich), 100 мкг/мл антимикробного агента Primocin™ (InvivoGen, США). Клетки распределяли в лунки 12-луночного планшета для адгезионных культур клеток (TPP, Швейцария) с конечным объемом среды в лунке 1 мл. Культивирование проводили при +37 °C, 5% CO₂ и влажности 95%. Через 24 ч культивирования производили смену среды. Последующую смену среды производили на 3-и, 7-е сутки культивирования. В среде определяли уровень прогестерона, IL-6, IL-10, IFNγ на 1-е, 3-и, 7-е сутки культивирования. Ежедневное наблюдение за клетками осуществляли с помощью инвертированного микроскопа CKX41 (Olympus, Япония), оснащенного системой фазового контраста. Съемку проводили камерой AxioCam5 (Carl Zeiss, Германия) с помощью лицензионного программного обеспечения Zen 2, Blue Edition (Carl Zeiss).

Анализ состояния клеток осуществляли с помощью окрашивания флуоресцентными красителями с последующей проточной цитометрией. Клетки открепляли из лунок планшета с помощью смеси 0,05% трипсина-0,02% EDTA (Sigma-Aldrich), осаждали центрифугированием при 500 g в течение 5 мин при RT. К осадкам клеток из индивидуальных лунок добавляли 100 мкл смеси красителей: 4›,6-диамидино-2-фенилиндол (ДАПИ, Sigma-Aldrich) в конечной концентрации 1 мкг/мл для окрашивания погибающие клеток, H2DCFDA (Sigma-Aldrich) в конечной концентрации 10 мкг/мл для окрашивания клеток с функционально-активными митохондриями, TO-PRO-3™ (Thermo Scientific, США) в конечной концентрации 1 мкМ для окрашивания апоптотических клеток. Окрашивание производили в течение 10 мин при RT. После этого суспензии анализировали на проточном цитофлуориметре CytoFLEX S (Beckman-Coulter, США), подключенном к компьютеру с лицензионным программным обеспечением CytExpert (v. 2.5, Beckman Coulter).

Результаты и обсуждение

Показатели содержания в культуральных средах прогестерона, IL-6, IL-10, IFNγ у здоровых доноров и при СПКЯ представлены в таблицах 1, 2. В исследовании установлено, что в получаемой адгезивной культуре КК продолжается синтез прогестерона, IL-6, IL-10 данными клетками (табл. 1, 2). Исключение составила культура клеток при СПКЯ, в которой продукция, IFNγ прогрессивно снижалась по сравнению с контролем, и к 7-му дню эксперимента была зафиксирована на минимальном уровне (табл. 1).

При сравнимом исходном уровне прогестерона в обеих клеточных культурах – при СПКЯ и здоровых доноров, и на 3-и сутки эксперимента показатели гормона оставались соизмеримыми, но на 7-е сутки зафиксировано резкое возрастание значений прогестерона при СПКЯ (p < 0,01), что вполне согласуется с данными исследований о негативном прогнозе ЭКО при СПКЯ при значимом нарастании значений прогестерона в крови пациенток [8, 15]. Ряд авторов указывали на сниженный потенциал развития ооцитов у пациенток с СПКЯ и его зависимости от уровня прогестерона, который тесно связан с наступлением беременности, трансформацией эндометрия из пролиферативной стадии в секреторную, имплантацию и роста эмбриона [3, 8, 15]. Наши данные на монокультуре КК отчетливо доказывают эту зависимость от прогестерона, указанную в клинических исследованиях. Раннее повышение прогестерона при СПКЯ расширяет «окно рецептивности» эндометрия, что приводит к асинхронности между эндометрием и эмбрионом, и, следовательно, к неудаче имплантации и исхода беременности [8, 15]. Возможно, учитывая наши данные, гиперпродукция прогестерона обеспечивается КК, и ее ранняя верификация позволит таргетно корректировать проблему в будущем.

Содержание IL-6 при СПКЯ исходно значимо (более чем в 3 раза) превышало аналогичный показатель здоровых доноров (табл. 1, 2), но темпы нарастания цитокина у здоровых лиц были значимо выше, и через 7 дней эксперимента IL-6 у них зафиксирован в 4 раза выше, чем в группе СПКЯ. Этот феномен может свидетельствовать о релевантном истощении функционального потенциала КК. Аналогичная ситуация имела место в содержании IL-10 в культуральных средах: при исходно более высоком уровне цитокина при СПКЯ, темпы его нарастания и, следовательно, синтеза клетками при СПКЯ вначале замедлялись (к 3-м суткам), а затем резко снижались к 7-м суткам по сравнению со здоровыми женщинами (табл. 1, 2). Данные также подтверждают высказанное выше предположение о функциональном дефиците КК при СПКЯ в плане продукции цитокинов.

Содержание IFNγ в культуре КК здоровых женщин было исходно в 2 раза ниже, чем при СПКЯ (табл. 1, 2). Однако на 7-е сутки, синтез IFNγ клетками обеих групп резко снизился (табл. 1, 2). Более резкое и значимое снижение синтеза IFNγ клетками при СПКЯ через неделю эксперимента нарушило исходно вполне релевантный баланс цитокинов: исходно соотношение IFNγ / IL-10 при СПКЯ составило 1,7 против 1,88 у здоровых доноров. После 7 дней культивирования КК, баланс синтезируемых при СПКЯ цитокинов (IFNγ / IL-10) резко снизился до 0,27 против 2,38 у здоровых лиц, что ясно демонстрирует глубину тканевого дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов при поликистозе яичников и истощение функциональных свойств КК при СПКЯ.

 

Рисунок 1. Данные по результатам ЭКО у здоровых женщин, принимавших участие в исследовании, и при синдроме поликистозных яичников

Figure 1. Data from IVF results in healthy women and those with polycystic ovary syndrome who participated in the study

 

Значимые разнонаправленные изменения уровня цитокинов в монокультуре кумулюсных клеток при СПКЯ, по сравнению со здоровыми донорами, могут служить определяющими факторами формирования бластоцистов и, следовательно, исхода беременности при ЭКО. Дальнейшее изучение этого вопроса весьма актуально, так как именно на 5-7-е сутки формирования бластоцистов происходит отбор ооцитов для вступления в цикл экстракорпорального оплодотворения. Изменение показателей цитокинов в культуре клеток и результаты наступления беременности у этих женщин (рис. 1) дают возможность прогнозировать результаты вспомогательных репродуктивных технологий и, в дальнейшем, корректировать эти нарушения с помощью восстановления баланса цитокинов. Для пациенток с синдромом поликистозных яичников проведение успешной вспомогательной репродуктивной технологии является зачастую единственным шансом реализовать свой репродуктивный потенциал.

Выводы

1. Содержание и синтез прогестерона в монокультурах кумулюсных клеток у здоровых женщин и пациенток с СПКЯ имеет значимые отличия, избыточная активация стероидпродуцирующей функции КК при СПКЯ продемонстрирована в резком возрастании значений прогестерона в этой культуре КК в сравнении со здоровыми клетками через 7 дней наблюдения.
2. Продукция и динамика синтеза IFNγ в монокультурах кумулюсных клеток здоровых лиц и при СПКЯ имеет значимые отличия. Резкое снижение синтеза исходно более высокого IFNγ при СПКЯ через неделю эксперимента значимо нарушило баланс цитокинов – снизился показатель IFNγ / IL-10 при СПКЯ в 8,8 раза по сравнению со здоровыми клетками, что ясно демонстрирует глубину тканевого дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов при поликистозе яичников и истощение цитокинпродуцирующих функциональных свойств КК при СПКЯ.
3. При анализе результатов синтеза IL-6 в монокультурах кумулюсных клеток выявлены значимые отличия функции здоровых клеток: содержание IL-6 при СПКЯ имело трехкратно превышение исходно, но темпы нарастания цитокина у здоровых КК за 7 дней превысили КК при СПКЯ и значимо возросли (в 4 раза) в конце эксперимента.
4. Синтез IL-10 и его динамика в монокультурах кумулюсных клеток также имел значимые отличия – при более высоком исходном уровне цитокина при СПКЯ, темпы его нарастания и, следовательно, синтеза кумулюсными клетками в первые трое суток замедлялись, а затем резко снижались к 7-м суткам эксперимента по сравнению со здоровыми КК. Результаты исследования цитокинов в монокультурах ясно свидетельствуют о феномене активационного истощения КК при СПКЯ.

About the authors

Olga V. Valikova

Pacific State Medical University; Regional Clinical Hospital No. 2; Clinic for Diabetes and Endocrine Diseases

Author for correspondence.
Email: renalex.99@mail.ru

Clinical Endocrinologist

Russian Federation, 6, Vladivostok Ostyakova st., Vladivostok 690000; 55, st. Russian, Primorsky Territory, Vladivostok, 690000; Vladivostok

Victoria V. Zdor

Pacific State Medical University; Clinic for Diabetes and Endocrine Diseases

Email: victoria.zdor@mail.ru
Russian Federation, 6, Vladivostok Ostyakova st., Vladivostok 690000; Vladivostok

Yakov N. Tikhonov

Pacific State Medical University

Email: victoria.zdor@mail.ru

Senior Lecturer, Department of Pathological Anatomy

Russian Federation, 6, Vladivostok Ostyakova st., Vladivostok 690000

Andrey Victorovich Boroda

A. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences

Email: borodandy@gmail.com

PhD (Biology), Senior Research Associate, Deputy Director for Research

Russian Federation, Vladivostok

Alina M. Gracheva

Clinic of Reproduction and Genetics “Next Generation Clinic”

Email: borodandy@gmail.com

Chief Physician, Obstetrician-Gynecologist

Russian Federation, Vladivostok

Konstantin G. Kolbin

Clinic of Reproduction and Genetics “Next Generation Clinic”

Email: borodandy@gmail.com

PhD (Biology), Embryologist

Russian Federation, Vladivostok

References

Supplementary files