Level of some matrix metalloproteinases in blood serum in relation to their genetic polymorphism depending on age

Full Text

Введение

Долголетие представляет собой социально-биологическое явление, выражающееся в достижении человеком значительного возрастного рубежа и определяющееся сложной системой взаимосвязанных внутренних (генетических) и внешних (среда) факторов [1, 2]. Оно может быть связано как с отдельными людьми (индивидуальное долголетие), так и с популяциями в целом (популяционное долголетие). Среди макрорегионов России по абсолютной численности долгожителей, их доле в общей численности населения и по величине индекса долгожительства лидирует Центральный федеральный округ [2]. Аутсайдером же по всем данным параметрам является Дальневосточный федеральный округ. Старение можно описать как многофакторный процесс, включающий сложные взаимодействия между биологическими и молекулярными механизмами [3]. Способность различать нормальное биологическое старение и нарушение здоровья – важная область, в которой существует мало экспериментальных данных. Важной целью остается обеспечение точных показателей или предикторов возникновения ухудшения здоровья, а также способность охарактеризовать состояние оптимального здоровья, соответствующего возрасту. В связи с востребованностью изучения информативных биомаркеров старения с каждым годом растет количество потенциальных генов, определяющих фенотип старения. Согласно данным мировой науки, существует два пути постарения: первый путь не отягощен возраст-ассоциированными заболеваниями, в то время как второй характеризуется прогрессирующей тенденцией к воспалению, инвалидизации и возрастным заболеваниям [2]. Поэтому ключевым моментом для установления роли полиморфного локуса в старении можно считать проведение работ по исследованию маркеров старения и их генетической регуляции соответственно возрастным категориям. В роли возможных предикторов патологического старения могут выступать внеклеточные протеиназы, представляющие собой группу белков, которые активируют субстраты путем ферментативного расщепления. Эта группа белков контролирует большое разнообразие ключевых физиологических и патологических процессов, включая ремоделирование тканей, репликацию ДНК, прогрессирование клеточного цикла, нейродегенерацию и др. Исследований, направленных на выявление маркеров физиологического и патологического старения человека – единичны, а исследования, включающие регуляцию этих маркеров на уровне генома, вообще отсутствуют.

Цель исследования – проанализировать генетические полиморфизмы ММР-1 и ММР-3 и их уровни в сыворотке крови у условно здоровых мужчин и женщин разного возраста.

Материалы и методы

В исследование было включено 180 человек (мужчины составили 80 человек, женщины составили 100 человек, распределенных по возрасту (ВОЗ). Обследуемые проходили первый этап диспансеризации на клинических базах ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России. У пациентов производился однократный забор материала (буккальный эпителий) для ПЦР-анализа полиморфизмов, исследование проводили на приборной базе ДНК-амплификатора Bio-Rad CFX96. Для генотипирования выбранных нами полиморфных локусов ДНК была использована технология ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени с использованием конкурирующих флуоресцентных TaqMan-зондов. Каждая тест-система включала в себя два олигонуклеотидных праймера (прямой и обратный) и два флуоресцентных зонда, несущих «гаситель» (BHQ или BHQ2) на 3’-конце и разные флуоресцентные красители (FAM либо HEX) на 5’-конце зондов. Исследование полиморфизмов генов ММР-1 rs1799750 (с аллелями G/G,-/G,-/) и MMP-3 rs 3025058 (с аллелями 5А/5А, 5А/6А, 6А/6А) проведено в г. Новосибирск (ООО «Национальный центр генетических исследований»). Уровни MMP-1, MMP-3 в сыворотке крови исследовали методом сендвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа (R&D Diagnostics Inc., США). Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием программы IBM SPSS Statistics 26 методами непараметрической статистики; для анализа полученных данных использовали критерий Шапиро–Уилка. U-критерий Манна–Уитни и Вилкоксона, дисперсионный анализ Краскела–Уоллиса, ранговую корреляцию по Спирмену, метод отношения шансов.

Результаты и обсуждение

В группе условно здоровых женщин среднего возраста нами зафиксирован достоверно более высокий уровень MMP-1 в сыворотке крови (р = 0,01, табл. 1), при этом значения ММР-1 в возрасте 18-44 лет и 60 и более были сопоставимы. Уровни ММР-3 в группе молодого и пожилого возраста были сопоставимы и ниже значений групп среднего и старческого возрастов, при этом самые низкие значения установлены в группе молодого возраста (р = 0,05), а высокие – в группе женщин старше 75 лет (р = 0,035). При анализе полиморфизмов гена ММР-1 rs1799750 у женщин молодого возраста с большим удельным весом превалировал гомозиготный генотип -/- (нормальная активность гена) при низком сывороточном уровне ММР-1 (0,54 нг/мл и 0,59 нг/мл, соответственно). У женщин среднего возраста выявлено преобладание генотипа G/G с высокой степенью активности гена и высокими сывороточными уровнями ММР-1. В группе пожилого выявлена статистически более высокая встречаемость генотипа -/G в 79% с уровнем ММР-1 0,52 нг/мл. У женщин старше 75 лет зафиксировано носительство гомозиготы -/G в 87% с уровнем ММР-1 0,56 нг/мл. Оценка распределения аллелей ММР-3 rs 3025058 у условно здоровых женщин позволила установить, что у женщин молодого возраста достоверно чаще встречался полиморфизм 5А/5А с высокой экспрессионной активностью гена и с уровнем ММР-3 12,9 нг/мл. В среднем и пожилом возрасте в 65% установлен гетерозиготный аллель 5А/6А с нормальной экспрессионной активностью гена, а в старческом возрасте – генотип 6А/6А с низкой активностью гена, но с высоким уровнем ММР-3 в сыворотке крови, в среднем достигающим 15,9 нг/мл.

 

Таблица 1. Содержание матриксных металлопротеиназ в сыворотке крови у условно здоровых женщин разного возраста (медианные значения и соответствующие доверительные интервалы, Me (Q_0,25-Q_0,75))

Table 1. Content of matrix metalloproteinases in blood serum in conditionally healthy women of different ages (median values and corresponding confidence intervals, Me (Q_0.25-Q_0.75))

Показатель Indicators	Практически здоровые женщины Practically healthy women n = 100
	Молодой возраст Young age n = 30	Средний возраст Middle age n = 25	Пожилой возраст Old age n = 25	Старческий возраст Senile age n = 20
	1	2	3	4
ММР-1, нг/мл ММР-1, ng/mL	0,53 (0,41-0,60) р1-2 = 0,034	0,66 (0,57-0,71) р2-3 = 0,01	0,57 (0,42-0,69)	0,54 (0,40-0,73) р2-4 = 0,028
ММР-3, нг/мл ММР-3, ng/mL	13,2 (12,6-16,1) р1-2 = 0,05	15,0 (12,5-18,9)	14,5 (13,4-16,6) р3-4 = 0,042	16,1 (12,9-18,3) р1-4 = 0,035

Примечание. Достоверность различий по возрасту определяется при p-value ≤ 0,05.

Note. The reliability of age differences is determined at p-value ≤ 0.05.

 

При анализе данных условно здоровых мужчин уровень ММР-1 в сыворотке крови был сопоставим с уровнем в молодом, среднем и пожилом возрасте (табл. 2), тогда как достоверно высокие показатели зарегистрированы в старческом возрасте. Значения ММР-3 были ниже в группе молодого возраста (11,1 нг/мл), а в группе пожилого возраста они были равны 13,3 нг/ мл (табл. 2). В структуре распределения генотипов ММР-1 rs1799750 у мужчин до 75 лет выявлен гетерозиготный аллель -/G у 80% с уровнем ММР- 1 0,62 нг/ мл. В группе мужчин старше 75 лет превалировал гомозиготный вариант G/G с уровнем ММР-1 0,74 нг/мл. Гомозиготный полиморфизм гена ММР-3 rs 3025058 5А/5А превалировал в группах мужчин до 60 лет с уровнем ММР-3 100,2 нг/мл и 92,5 нг/мл соответственно. У мужчин старше 60 лет зафиксирован гомозиготный аллель 6А/6А с более низким уровнем ММР-3 56,8 нг/мл.

 

Таблица 2. Содержание матриксных металлопротеиназ в сывортке крови у условно здоровых мужчин разного возраста (медианные значения и соответствующие доверительные интервалы, Me (Q_0,25-Q_0,75))

Table 2. Content of matrix metalloproteinases in blood serum in conditionally healthy men of different ages (median values and corresponding confidence intervals, Me (Q_0.25-Q_0.75))

Показатель Indicators	Практически здоровые мужчины Practically healthy men n = 80
	Молодой возраст Young age n = 20	Средний возраст Middle age n = 20	Пожилой возраст Old age n = 20	Старческий возраст Senile age n = 20
	1	2	3	4
ММР-1, нг/мл ММР-1, ng/mL	0,6 (0,53-0,73)	0,67 (0,59-0,78) р2-4 = 0,05	0,61 (0,54-0,70) р3-4 = 0,035	0,76 (0,65-0,79) р1-4 = 0,034
ММР-3, нг/мл ММР-3, ng/mL	11,1 (11,5-14,1)	12,1 (10,4-14,3) р2-3 = 0,42	13,3 (6,6-16,0) р1-3 = 0,041	12,0 (12,1-14,0) р3-4 = 0,05

Примечание. Достоверность различий по возрасту определяется при p-value ≤ 0,05.

Note. The reliability of age differences is determined at p-value ≤ 0.05.

 

Важно, что ММР являются медиаторами стерильного воспаления при старении и возрастных заболеваниях. Несмотря на то, что средняя продолжительность жизни населения в мире увеличивается, сохраняются значительные последствия процесса старения. Возраст считается независимым и решающим фактором риска патологического старения. Старение клеток сосудов индуцирует сложные изменения структуры и функций эндотелия. Выявление, так называемых, признаков или биомаркеров старения стало преимуществом для исследований в этой области, поскольку оно позволило изучить патофизиологические механизмы и отсрочить появление множества связанных с возрастом синдромов и симптомов. Важно отметить, что относительно небольшое количество стареющих клеток (10%) достаточно для распространения клеточного старения на окружающие клетки в ткани [3].

Появляются все новые подтверждения перекрестной вовлеченности в процессы старения генов-кандидатов, ассоциированных с продолжительностью жизни. Для генов ММР, как и для многих других генов, характерен полиморфизм – наличие в популяции аллелей с той или иной нуклеотидной последовательностью. Полиморфные генетические локусы могут не вызывать никаких изменений в фенотипе, а могут иметь функциональный эффект, оказывая влияние на уровень экспрессии гена и количество белкового продукта, либо на стабильность и функциональные характеристики белка как фермента [3, 4]. К настоящему времени в генах MMР описан ряд функциональных однонуклеотидных полиморфных замен (single nucleotide polymorphism – SNP), расположенных в регуляторных регионах генов (промоторах) и изменяющих уровень экспрессии ММР. Гены ММР картированы на хромосомах 1, 8, 11, 14, 16, 20, 22. Большинство их них расположено кластером на плече 11-й хромосомы (речь идет о ММР-1, ММР-3, ММР-7, ММР-8, ММР-10, ММР-12, ММР-13, ММР-20) [4, 5, 6].

Ген ММР-1 является наиболее экспрессирующимся. Экспрессия гена MMР-1 в основном контролируется уровнем транскрипции и стабильности мРНК. С другой стороны, подавляют транскрипцию ММР-1 – трансретиноевая кислота и трансформирующий фактор роста â (Pietrzak J. и соавт., 2019).

Цитокины, которые повышают уровень транскрипции MMР-3, включают фактор роста фибробластов, эпидермальный фактор роста, колониестимулирующий фактор макрофагов и интерфероны â и ã [3]. Durmanova V. и соавт. (2021) сосредоточились на ММР-2 и ММР-3 из-за их участия в процессах, связанных с нейродегенерацией. ММР-3, также известный как стромелизин-1, представляет собой белок массой 54 кДа, продуцируемый различными клетками, включая макрофаги, стромальные фибробласты, эндотелиальные клетки, иммунные клетки и синовиальные клетки [3]. Он участвует в протеолизе различных молекул адгезии, факторов роста, цитокинов (TNF и IL-1â) и проформ других ММP, таких как proMMP-1, proMMP-3 и proMMP-9. ММP-3 представляет собой «скрытую» металлопротеиназу, главным образом вырабатываемую клетками соединительной ткани, активируется через проколлагеназу-1 и деградирует компоненты экстрацеллюлярной матрицы протеогликан, фибронектин, желатин и различные типы коллагенов. ММР-3 имеет широкий диапазон субстратной специфичности и обладает способностью активировать другие ММP, что суммарно вызывает деградацию большинства компонентов экстрацеллюлярного матрикса. В головном мозге ММР-3 необходим для роста нейритов, пластичности нейронов и ремиелинизации [4].

Учитывая вышеизложенное и в связи с увеличением доли лиц, страдающих синдромами, связанными со старением организма, является актуальной идентификация молекулярно-генетических факторов, обеспечивающих продление активного возрастного периода с сохранением физической, психической, умственной активности и в целом способствующих успешному долголетию. Таким образом, долголетие часто характеризуется не уникальным и однозначным фенотипом – их может быть несколько.

Выводы

1. Значения ММР-1 и ММР-3 в группе условно здоровых женщин в молодом возрасте были ниже значений среднего возраста, кроме того, в старческом возрасте они изменялись разнонаправленно: ММР-1 уменьшались, а ММР- 3 – увеличивались. При анализе полиморфизмов гена ММР-1 rs1799750 у женщин молодого и среднего возраста с большим удельным весом превалировал гомозиготный генотип -/- с низкой экспрессией гена ММР-1, а у женщин старше 75 лет зафиксировано носительство гомозиготы G/G с высокой экспрессией гена. ММР-3 rs 3025058 у женщин молодого возраста достоверно чаще встречался полиморфизм 5А/5А с высокой экспрессией, но с более низким уровнем ММР-3. В среднем и пожилом возрасте в 65% установлен гетерозиготный аллель 5А/6А с пониженной экспрессионной активностью гена, а в старческом возрасте генотип 6А/6А с малой активностью гена, но с высоким уровнем сывороточной ММР-3.
2. У условно здоровых мужчин ММР-1 повышалась в группах среднего и старческого возрастов, значения ММР-3 были высокими в группе пожилого возраста. ММР-1 rs1799750 у большинства мужчин до 75 лет идентифицировался в варианте -/G, а в группе мужчин старше 75 лет превалировал гомозиготный вариант G/G с уровнем ММР-1 0,74 нг/мл. Гомозиготный полиморфизм гена ММР-3 rs 3025058 5А/5А с высокой эскпрессией превалировал в группах мужчин до 60 лет с уровнем ММР-3 100,2 нг/мл и 92,5 нг/мл соответственно, что было достоверно выше уровней групп старше 60 лет.

About the authors

N. S. Chepurnova

Pacific State Medical University

Author for correspondence.
Email: dr.cns@yandex.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Normal and Pathological Physiology

Russian Federation, Vladivostok

S. V. Knysh

Pacific State Medical University

Email: dr.cns@yandex.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Normal and Pathological Physiology

Russian Federation, Vladivostok

V. N. Jushhuk

Pacific State Medical University

Email: dr.cns@yandex.ru

Assistant, Department of Public Health

Russian Federation, Vladivostok

S. V. Lebedev

Pacific State Medical University

Email: dr.cns@yandex.ru

Vice-Rector for Development

Russian Federation, Vladivostok

A. A. Harchenko

Pacific State Medical University

Email: dr.cns@yandex.ru

Student, Medical Faculty

Russian Federation, Vladivostok

References

Supplementary files