On the issue of experimental modeling of invasions and prospects for the use of immunostimulants in nematodes

Full Text

Введение

В настоящее время актуален поиск путей преодоления лекарственной устойчивости к антигельминтикам. Данная проблема решается за счет ограничения длительности применения препаратов с одинаковым механизмом действия и комбинированием антигельминтиков. Представленные в статье исследования показали, что также весьма перспективно применение иммунотропных препаратов. Вышесказанное подтверждается тем, что в паразитологических исследованиях установлена высокая эффективность полиоксидония в отношении приживаемости личинок трихинелл, которая сопровождалась увеличением площади лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником и белой пульпы селезенки, в которой разрастались лимфоидные фолликулы. Таким образом, полиоксидоний является эффективным препаратом, который можно использовать при комплексном лечении нематодозов, как иммунотропное средство.

Широко известно о стремительном распространении резистентности к антибиотикам среди возбудителей инфекционных заболеваний, менее освящается в научной литературе нарастание устойчивости гельминтов (особенно, нематод) к антигельминтикам. Известно, что уже в середине прошлого века антигельминтные препараты начали резко терять свою эффективность при дегельминтизациях. В этой связи в 90-х годах постепенно в США, а потом в ряде стран ЕС свободная продажа антигельминтиков была законодательно запрещена [2, 3, 4, 6]. В настоящее время в РФ против нематод чаще всего используются и представлены в открытом доступе такие препараты как макроциклические лактоны и бензимидазол и его производные (альбен, альбен-нео, мебендазол и др.). Известно, что производные бензимидазола влияют на подвижность, нарушение транспорта веществ внутри клетки и опорную функцию цитоскелета нематод. В результате наступает гибель клетки и тканей гельминта. Однако мутация в гене, кодирующем структуру тубулина, привела к появлению устойчивости к антигельминтикам этой группы [3, 5, 12]. В случае с макроциклическими лактонами (ивермектин, авермектин и др.) мутируют гены, кодирующие а-субъединицы глутамат-зависимых С1-каналов, и гены, кодирующие белки коннексины, входящие в состав щелевых контактов, что также приводит к появлению устойчивости. Учитывая вышесказанное, в настоящее время крайне актуален поиск экологически безопасных соединений с сочетанными механизмами противопаразитарного и иммуномодулирующего действия. И таким образом преодоление лекарственной устойчивости микроорганизмов и гельминтов является одной из важных проблем, возникающих на стыке современной паразитологии и иммунологии [2, 3, 13]. Это подразумевает одновременное использование двух и более антигельминтных препаратов с разным механизмом действия и обязательное введение в схему лечения нематодозов иммунотропных препаратов [2, 4, 13, 14].

Нематодозы (сифациоз, трихинеллез, аскаридоз и др.) достаточно часто воспроизводятся при экспериментальном моделировании гельминтозов. Помимо этого, некоторые из них, например трихинеллез, являются одним из наиболее опасных гельминтозов человека и животных. В связи с чем некоторые варианты данной инвазии были использованы нами в паразитологических экспериментальных моделях на основе воспроизведения инвазии у лабораторных животных следующими видами: Trichinella spiralis, Trichinella nativа. Экспериментальное воспроизведение трихинеллеза при инокуляции Trichinella spiralis доводбно удобно и распространено в паразитологии как для доклинических исследований, так и среди научных изысканий по изучению иммунного ответа при нематодозах [2, 8, 9, 13]. Эти модели становятся перспективными для современной гельминтологии благодаря возможности точного подсчета личинок, и поэтому изучение действия иммунотропных препаратов паразитологи начинали именно при использовании этого гельминтоза [4, 10, 11, 13, 14]. Тем не менее сведения о применении препаратов с иммунотропной активностью в лечении трихинеллеза фрагментарны, а на практике эта область малоизучена. Например, известно о применении при экспериментальном и спонтанном трихинеллезе рекомбинантного IL-2, нуклеината натрия, продигиозана, азоксимера бромида, ряда пробиотиков и др., однако рекомендации в нормативных документах РФ по их использованию отсутствуют.

Целью данного исследования стало изучение эффективности применения ряда иммунотропных препаратов на различных лабораторных моделях (животных и птиц) и оценка моделирования экспериментальной инвазии Trichinella spiralis и Trichinella nativа.

Материалы и методы

Работа проведена на базе Вятского ГАТУ (морфометрические исследования) и центра ВНИИП – филиал ФГБНУ ФНЦ – ВНИИЭВ (экспериментальное моделирование трихинеллезной инвазии). Для экспериментального моделирования инвазий Trichinella spiralis, Trichinella nativа использовали 40 белых мышей, 20 белых крыс. Были изучены изменения в лимфоидной ткани, ассоциированной в кишечнике, в селезенке, а также в периферической крови животных и птиц при инокуляции вышеуказанных видов. Далее, на отработанных моделях инвазий Trichinella spiralis исследовали влияние препаратов с иммунотропной активностью, для чего использовали использовали 30 белых мышей (массой 20,5±2,5 г) которые были рандомизированы и распределены на группы (6). Мышам группы № 1 (положительный контроль) вводили стерильный физиологический раствор 0,2 мл подкожно, двукратно, животным группы № 2 вводили азоксимера бромид (Полиоксидоний) в дозе 0,004 мг/мышь 2-кратно через день, животным третей группы вводили Ронколейкин в дозе 180 МЕ/мышь в 0,2 мл стерильного 0,9%-ного NaCl, мышам четвертой группы вводили деринат (нуклеинат натрия) двукратно с интервалом 24 ч 0,015 мг на мышь, 5-й группе вводили 0,015 мг амиксин перорально, 6-я группа служила отрицательным контролем. Мышам вводили через пищеводный зонд инвазионных (обладающих подвижностью) личинок Trichinella spiralis в дозе 80 личинок/животное за исключением контрольной группы (№ 6). Оценка протективных свойств иммунотропных препаратов при трихинеллезе осуществлялась на лабораторных моделях по определению приживаемости при исследованиях после эвтаназии всех мышей и подсчитывания количества личинок трихинелл. Оба эксперимента были проведены в соответствии с принципами Хельсинкской декларации [15]. После выведения лабораторных животных из эксперимента (в соответствии с принципами вышеуказанной декларации) проводили макро- и микроанатомические исследования и забор гистологического материала (комплектов кишечника и селезенок) для качественной и количественной оценки [1, 5, 6].

Результаты и обсуждение

При анализе лабораторных моделей при экспериментальном моделировании инвазий разными видами (Trichinella spiralis, Trichinella nativа) обнаружены отличия в течении патологического процесса и состояния лимфоидной ткани периферической иммунной системы. Также при инвазии одинаковым количеством возбудителя (общепринятая в гельминтологии доза – 40 личинок на грамм) у белых мышей при инвазии Trichinella spiralis клинические признаки отсутствовали, в то время как у мышей, инвазированных Trichinella nativа, летальность составила 20%. В то же время при инвазии крыс (2000 личинок на животное) не только отсутствовала летальность, но и обнаружили, что 20% крыс не заразились видом Trichinella nativа. Следовательно имеются значительные внутривидовые различия как у различных лабораторных животных (белых мышей, белых крыс), так и собственно, возбудителей [4, 5, 13]. Учитывая вышесказанное, для изучения эффективности иммунотропных препаратов использовали классические модели трихинеллеза белых мышей.

При введении полиоксидония приживаемость трихинелл была наиболее низкой (1,8±0,25), ронколейкина несколько ниже (3,5±1,8), в то время как при использовании нуклеината натрия и тиролона была близка к положительному контролю (7,5±3,4 и 6,5+5,8 к 10,8+1,6 соответственно).

В результате проведенных исследований установлено, что лимфоидная ткань, ассоциированная с кишечником, в частности ее сгруппированные образования – лимфоидные бляшки, реагирует на инвазию и введение иммунотропного препарата (у экспериментально зараженных трихинеллезом мышей их площадь 1,1 раза превышала площадь этих образований у мышей контрольной группы, еще большее увеличение лимфоидных бляшек отмечали у инвазированных Тrichinella spiralis мышей, получавших полиоксидоний в 1,2 раза). Во всех полях зрения при исследовании подслизистой основы кишечника инвазированных животных, получавших полиоксидоний, увеличено количество лимфоцитов, плазмобластов и плазмоцитов, по сравнению с неинвазированными животными, что характерно для антигенной стимуляции и согласуется с данными ряда авторов (Owen R.L., Piazza A.J., Ermak T.H., 1991; Terahara K., Yoshida M., Igarashi O., 2008) и наших предыдущих исследований [6, 7, 9, 10, 11, 12].

Также было изучено влияние иммуностимуляции на морфологию селезенки у всех животных, инвазированных Тrichinella spiralis, выявлены количественные (в виде соотношения площади красной и белой пульпы) и качественные (клеточный состав) изменения паренхимы. Фолликулы белой пульпы были увеличены в размере у всех инвазированных животных и получавших иммунотропные препараты, часто лимфоидные узелки сливались, образуя тяжи. У здоровых животных площадь красной пульпы превышала площадь остальных структур (составила 70±5% от площади органа), в то время как белая пульпа составила 26,5±5%, клеточный состав селезенки контрольных мышей имел типичное строение. У мышей с трихинеллезной инвазией площадь белой пульпы достигала 50% и более, так же, как и на фоне введения препаратов. Однако имеются качественные отличия в состоянии паренхимы органа. При исследовании клеточного состава селезенки у инвазированных животных, не получавших иммуностимуляторы, в некоторых полях зрения наблюдали пустоты. Известно, что многие хроничские инфекционные и инвазионные заболевания (в том числе трихинеллез), сопровождающиеся гиперфункцией селезенки, приводят к спленомегалии. При трихинеллезе основная провоцирующая причина (антигенное воздействие личинок) приводит к весьма длительному и интенсивному процессу избыточной активации лимфоцитов, при котором наступает гиперспленизм, характеризующийся уменьшением количества клеток в поле зрения, появлением пустот (особенно, при инвазии Trichinella nativа). Причиной возникновения гиперспленизма является длительное состояние гиперактивности органа, возникающее при постоянной стимуляции антигенами трихинелл, в результате общее состояние животного ухудшается из-за разрушения селезенкой форменных элементов крови (лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов), и снижения их уровня в плазме [9, 10, 12, 13].

Выводы

Учитывая, что лекарственная устойчивость гельминтов является наследственной преадаптацией, постепенно растет количество паразитических организмов, устойчивых к антигельминтикам, этому способствует применение субтерапевтических доз препаратов, особенно без их смены. В настоящее время эта проблема решается главным образом за счет ограничения длительности применения препаратов с одинаковым механизмом действия и комбинированием антигельминтиков, с дозой не ниже терапевтической. Проведенные исследования также показали, что, кроме применения комбинированных антигельминтиков, весьма перспективно применение иммунотропных препаратов. Вышесказанное подтверждается тем, что в паразитологических исследованиях установлена высокая эффективность полиоксидония в отношении приживаемости личинок трихинелл, которая сопровождалась увеличением площади лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником, и белой пульпы селезенки, в которой разрастались лимфоидные фолликулы. Таким образом, полиоксидоний является эффективным препаратом, который можно использовать при комплексном лечении нематодозов, как иммунотропное средство [10, 11, 12, 14].

About the authors

O. B. Zhdanova

K. Scriabin All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants; Vyatka State Agrotechnological University

Author for correspondence.
Email: Oliabio@yandex.ru

PhD, MD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Parasitic Zoonoses; Professor, Department of Physiology

Russian Federation, Moscow; Kirov

O. N. Andreianov

K. Scriabin All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants

Email: Oliabio@yandex.ru

PhD, MD (Veterinary Medicine), Leading Research Associate, Laboratory of Parasitic Zoonoses

Russian Federation, Moscow

A. K. Martusevich

Vyatka State Agrotechnological University

Email: Oliabio@yandex.ru

PhD, MD (Biology), Leading Research Associate, Laboratory of Innovative Technologies of Food Production

Russian Federation, Kirov

O. V. Chasovskich

Vyatka State Agrotechnological University

Email: Oliabio@yandex.ru

PhD (Veterinary Medicine), Head, Department of Physiology

Russian Federation, Kirov

References

Supplementary files