МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОГЛИЯ-ПОДОБНЫХ КЛЕТОК ИЗ МОНОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ДЕТЕЙ С АУТИЗМОМ

Резюме

Нарушения в согласованной работе нервной и иммунной систем в настоящее время признаются основными факторами инициации и прогрессии расстройств аутистического спектра (РАС). Ключевыми игроками в формировании нейровоспаления и нарушении синаптической пластичности выступают резидентные иммунные клетки мозга – микроглия. Исследования нейробиологических и нейроиммунологических механизмов, лежащих в основе РАС, ограничены отсутствием соответствующих экспериментальных моделей. В настоящее время одной из наиболее релевантных моделей для изучения функций микроглии человека и поиска персонифицированных терапевтических подходов к лечению нейропсихических заболеваний могут стать микроглия-подобные клетки, полученные из моноцитов периферической крови (MDMi).

Цель работы – оптимизация протокола получения микроглия-подобных клеток из моноцитов периферической крови детей с аутизмом, в количестве, достаточном для проведения функциональных тестов.

Объектами исследования были мононуклеарные клетки периферической крови, полученные от 18 детей (12 мальчиков и 6 девочек; в возрасте 6–12 лет, средний возраст – 8,2 года) с диагнозом «Ранний детский аутизм». Мононуклеары выделяли из периферической крови с помощью градиенте плотности «Фиколл». Методом пластинчатой адгезии при 24-часовом культивировании из мононуклеаров получали фракцию моноцитов. Моноциты культивировали 10 или 14 суток в бессывороточной среде RPMI-1640 c добавлением антибиотиков и разных коктейлей цитокинов для их дальнейшей дифференцировки в MDMi. Количество жизнеспособных клеток оценивали с помощью суправитального красителя DAPI, а их фенотип определяли по наличию специфических маркеров микроглии – P2RY12 и TMEM119, методом проточной цитометрии. Для статистических расчетов использовали программное обеспечение PAST v. 4.03.

В результате работы нами показано, что для индукции микроглия-подобных клеток из моноцитов периферической крови детей с аутизмом необходимо 10-ти дневное культивирование не менее 3´10⁵ клеток/в лунке, в среде RPMI-1640 со стабильным глутамином, антибиотиками и коктейлем из трех цитокинов: GM-CSF (10 нг/мл), IL-34 (100 нг/мл), IL-3 (10 нг/мл). Такие параметры культивирования позволяют получить около 6´10⁴ клеток, не менее 90% из которых экспрессируют на своей поверхности маркер микроглии – P2RY12⁺ и могут быть использованы в качестве модели для изучения механизмов патогенеза аутизма, а также поиска персонифицированных подходов к его лечению.