Methodological aspects of ex vivo-generated monocyte-derived microglia-like cells in children with autism

Full Text

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда в рамках проекта № 24-25-20072.

Введение

Нарушения в работе нервной и иммунной систем и их двунаправленных взаимодействий в настоящее время признаются основными факторами инициации и прогрессии расстройств аутистического спектра (РАС) [1]. Показано, что резидентные иммунные клетки мозга – микроглия, выступают ключевыми игроками в формировании нейровоспаления и нарушении синаптической пластичности, наблюдаемыми в центральной нервной системе лиц с РАС [1]. Исследования нейробиологических и нейроиммунологических механизмов, лежащих в основе РАС, ограничены отсутствием соответствующих экспериментальных моделей [4]. В настоящее время одной из наиболее релевантных моделей для изучения функций микроглии человека и поиска персонифицированных терапевтических подходов к лечению нейропсихических заболеваний могут стать микроглия-подобные клетки, полученные из моноцитов периферической крови (monocyte-derived microglia-like cells, MDMi) [8]. В последние десять лет разработаны подробные и надежные протоколы получения MDMi [5, 6, 7], которые тем не менее не имеют общепризнанной стандартизации [8] и могут быть трудны в реализации при некоторых патологических состояниях. Так, у детей с РАС венопункция обычно затруднена из-за повышенной тревожности, страха и/или поведенческих особенностей [2], что не позволяет произвести забор большого объема крови и получить достаточное количество MDMi. Кроме того, для моноцитов детей с РАС характерны динамические изменения функциональной активности, что может оказывать влияние на их способность к дифференцировке в MDMi в условиях in vitro.

Цель работы – оптимизация протокола получения микроглия-подобных клеток из моноцитов периферической крови детей с аутизмом, в количестве, достаточном для проведения функциональных тестов.

Материалы и методы

Микроглия-подобные клетки (MDMi) получали из моноцитов периферической крови согласно протоколу H. Quek и соавт. [7] с некоторыми модификациями.

Кровь из вены была собрана натощак в утренние часы у 18 детей с диагнозом по МКБ-10: F84.0 «Ранний детский аутизм» (12 мальчиков и 6 девочек; в возрасте 6-12 лет, средний возраст – 8,2 года). Всеми родителями или официальными представителями детей было подписано информированное согласие на участие в программе. В рамках обследования детям с аутизмом был проведен подсчет показателей лейкоцитарной формулы крови.

Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) были выделены центрифугированием (1,5 тыс. об/мин, 40 мин) на градиенте плотности «Фиколл» (1,077 г/см³, ООО «БиолоТ», Россия). Полученную фракцию МПК разводили в среде RPMI-1640 со стабильным глутамином (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением пенициллина-стрептомицина (100 ЕД/мл и 100 мкг/мл соответственно; ООО «БиолоТ», Россия) и 10% фетальной бычьей сыворотки (Biowest, Франция), до концентрации 1 × 10⁶ – 2 × 10⁶ клеток/мл; высевали в 6-луночные планшеты с адгезивной поверхностью (Jet Biofil, Китай) и культивировали 24 часа при 37 °C, 5% CO₂ для получения моноцитов.

После 24-часовой инкубации не адгезированные клетки удаляли, адгезированные клетки, соответствующие моноцитам, открепляли от поверхности лунок с помощью раствора Трипсин-Версена (ООО «БиолоТ», Россия). Количество моноцитов и их жизнеспособность определяли методом проточной цитометрии с помощью меченых флуорохромами антител – anti CD14-PerCP/Cyanine5.5 и суправитального красителя DAPI (Elabscience, Китай).

Для получения MDMi моноциты в концентрациях от 1 × 10⁵ до 6 × 10⁵ клеток/мл высевали в лунки 6-луночного планшета и культивировали в течение 10 или 14 дней при 37 °C, 5% CO₂ со сменой среды 1 раз в 2-3 дня. Для дифференцировки МПК в MDMi к среде RPMI-1640 со стабильным глутамином (ООО «БиолоТ», Россия) добавляли раствор пенициллина-стрептомицина (100 ЕД/мл и 100 мкг/мл соответственно; ООО «БиолоТ», Россия) и коктейль цитокинов (все – производства Cloud-Clone Corp., Китай) в следующих комбинациях: 1) GM- CSF (10 нг/мл) и IL-34 (100 нг/ мл); 2) GM-CSF (10 нг/мл), IL-34 (100 нг/ мл) и TGF-β (10 нг/ мл); 3) GM-CSF (10 нг/ мл), IL- 34 (100 нг/ мл) и IL-3 (10 нг/мл); 4) GM-CSF (10 нг/ мл), IL-34 (100 нг/ мл), TGF-β (10 нг/мл) и IL-3 (10 нг/ мл).

После 10 или 14 дней культивирования MDMi открепляли от поверхности лунок с помощью раствора Трипсин-Версена (ООО «БиолоТ», Россия). Для определения количества жизнеспособных клеток и фенотипа MDMi, клетки инкубировали с суправитальным красителем DAPI (Elabscience, Китай) и антителами, мечеными флуорохромами: anti P2RY12-PE (BioLegend, США) и anti TMEM119-Alexa Fluor 647 (BioLegend, США), согласно инструкциям производителей.

Исследования по иммунофенотипированию моноцитов периферической крови и MDMi выполнено на проточном цитометре Longсyte C3111 (Challenbio, Китай) в ЦКП «Клеточные и молекулярные технологии в радиобиологии» ФГБУН «Уральский научно-практический центр радиационной медицины Федерального медико-биологического агентства» (г. Челябинск).

На этапе статистической обработки принадлежность выборки нормальной генеральной совокупности проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Данные имели нормальное распределение и были представлены в виде средних значений и 95% доверительного интервала (ДИ). Оценку значимости различий между группами проводили методом однофакторного дисперсионного анализа с апостериорными попарными сравнениями по Тьюки. Для расчетов использовали программное обеспечение PAST v. 4.03.

Результаты и обсуждение

В нашем исследовании, для получения MDMi, у детей с аутизмом в возрасте от 6 до 12 лет было собрано от 3 до 7 мл венозной крови в пробирки с К₃ЭДТА. Медианные значения всех показателей лейкоцитарной формулы крови в группе обследованных нами детей с аутизмом находились в пределах возрастной нормы. У трех детей (16,7%) относительное количество целевой популяции клеток – моноцитов, выходило за верхние границы референсного диапазона, равного 2-10% от всех лейкоцитов.

Количество МПК, полученных нами при фракционировании клеток на градиенте плотности, было сопоставимо с данными H. Quek и соавт. [7] и составляло от 1 × 10⁶ до 4 × 10⁶ клеток/ мл. Тем не менее, как и в исследовании A. Llaves-Lopez и соавт. [5], мы увеличили плотность высева МПК, для получения моноцитов методом пластинчатой адгезии, со стандартизированного значения в 4 × 10⁵ клеток до 1 × 10⁶ – 2 × 10⁶ клеток на лунку. Такая модификация метода позволила нам получать от 1 × 10⁵ до 6 × 10⁵ моноцитов (99% живых клеток), среди которых более 77% экспрессировали на поверхности маркер CD14⁺ (среднее значение: 81,7%; 95% ДИ: 77,8-85,7%).

Критическими параметрами для получения MDMi из моноцитов периферической крови у детей с аутизмом в количестве, достаточном для проведения функциональных тестов, в том числе, определения маркеров микроглии с помощью метода проточной цитометрии, стали: начальное число моноцитов в лунке (0-й день), длительность инкубации и количество клеток в лунке на финальный день культивирования. Так, к 14- му дню инкубации, количество клеток в лунке варьировало в среднем от 6,6% до 12,2%, от исходной концентрации клеток, что согласуется с данными M. Ohgidani и соавт. [6]. Тем не менее абсолютные значения были ниже 1 × 10⁴ клеток в лунке, что не позволяло провести определение их фенотипа. На основании протоколов некоторых исследований [8] нами было принято решение сократить время культивирования клеток до 10 дней. Также нами было установлено, что при начальной концентрации моноцитов от 1 × 10⁵до 3 × 10⁵ клеток/в лунке (0-й день), на 10-й день инкубации количество живых клеток варьировало в диапазоне 1 × 10⁴ – 4 × 10⁴ (9,0-13,7% от начальной численности). Если на 0-й день инкубации моноцитов было больше 3 × 10⁵ клеток/в лунке, то процент живых клеток на 10-й день статистически значимо увеличивался в 2-2,5 раза, до 21,2-28,3%.

Наконец, в существующих протоколах получения MDMi из МПК, используются разные комбинации цитокинов для поддержания жизнеспособности и дифференцировки клеток [5, 6, 7, 8]. Наиболее часто применяют два фактора: GM- CSF (10 нг/мл) и IL-34 (100 нг/мл). Нами показано, что при таком коктейле цитокинов, уже на 10-й день культивирования, 74,4% клеток несут специфичный для микроглии маркер P2RY12⁺, 59,5% – TMEM119⁺ и 57,3% клеток – оба маркера (табл. 1).

 

Таблица 1. Влияние различных комбинаций цитокинов на экспрессию P2RY12⁺ и TMEM119⁺ микроглия-подобными клетками на 10-й день культивирования, M (95% ДИ)

Table 1. Effect of various cytokine combinations on the P2RY⁺ and TMEM119⁺ expression by microglia-like cells at day 10 of cultivation, M (95% CI)

Комбинация цитокинов Сytokine combinations	P2RY12+, %	TMEM119+, %	P2RY12+/TMEM119+, %
GM-CSF/IL-34	74,4 (72,0-76,8)	59,5 (56,6-62,3)	57,3 (43,9-60,4)
GM-CSF/IL-34/IL-3	96,1* (90,0-99,2)	72,1 (47,2-97,0)	67,0 (54,0-79,9)

Примечание. * – значимые различия между показателями при стимуляции клеток двумя и тремя цитокинами (р ≤ 0,05).

Note. *, significant differences between the indices when cells were stimulated with two and three cytokines (p ≤ 0.05).

 

Далее нами была предпринята попытка повысить численность клеток и процент клеток, экспрессирующих специфические маркеры микроглии, на конец срока культивирования. Для этого в качестве третьего фактора к GM-CSF и IL-34 был добавлен: TGF-β (10 нг/мл), или IL-3 (10 нг/ мл), а также создана комбинация на основе всех 4 цитокинов. По данным T.J. Sargeant и соавт., TGF-β требуется для развития зрелой микроглии in vitro и помогает поддерживать покоящийся фенотип микроглии, полученной из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, но редко используется при получении MDMi из моноцитов периферической крови [8]. Добавление нами TGF-β (10 нг/мл) в среду культивирования, не зависимо от комбинации цитокинов (3/4 фактора), приводило к смерти всех клеток путем апоптоза на 5-7-е сутки культивирования (в лунке вместо клеток появлялись образования, по морфологии похожие на апоптические тельца). Данный эффект требует дополнительного изучения.

IL-3 (10 нг/мл) был добавлен нами в попытке повысить численность выживших клеток на конец срока культивирования. Согласно данным литературы, IL-3 способствует пролиферации микроглии как в условиях in vivo, особенно при нарушениях работы мозга, так и в условиях in vitro [3]. В результате нами не обнаружено значимых различий в количестве выживших клеток на 10-й день культивирования при сравнении среды с добавлением IL-3 или без него. Процент выживших клеток при использовании коктейля из двух цитокинов (GM-CSF и IL-34) составил 24,7% от начальной концентрации моноцитов в лунке, из трех цитокинов (GM-CSF, IL-34 и IL-3) – 25,0%. Тем не менее при введении в среду культивирования IL-3, 72,1% MDMi экспрессировали на своей поверхности маркер микроглии – TMEM119⁺, а 96,1% – P2RY12⁺. Для P2RY12⁺ различия были статистически значимыми по сравнению с аналогичными показателями при использовании коктейля из двух цитокинов: GM-CSF и IL-34 (табл. 1).

Заключение

Таким образом, по итогам проведенного пилотного исследования, мы установили, что для индукции микроглия-подобных клеток из моноцитов периферической крови детей с аутизмом необходимо 10-дневное культивирование не менее 3 × 10⁵ клеток/в лунке, в среде RPMI-1640 со стабильным глутамином, антибиотиками и коктейлем из трех цитокинов: GM-CSF (10 нг/ мл), IL-34 (100 нг/мл), IL-3 (10 нг/мл). Такие параметры культивирования позволяют получить около 6 × 10⁴ клеток, не менее 90% из которых экспрессируют на своей поверхности маркер микроглии – P2RY12⁺ и могут быть использованы в качестве модели для изучения механизмов патогенеза аутизма, а также поиска персонифицированных подходов к его лечению.

About the authors

Yuliya Yu. Filippova

Chelyabinsk State University

Author for correspondence.
Email: julse@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-5041-6440

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Professor, Department of Microbiology, Immunology and General Biology, Faculty of Biology

Russian Federation, 129 Bratiev Kashirinykh St, Chelyabinsk, 454001

Kseniya A. Rusakova

Chelyabinsk State University

Email: ksenya.antipina.97@mail.ru

Postgraduate Student, Department of Microbiology, Immunology and General biology, Faculty of Biology

Russian Federation, 129 Bratiev Kashirinykh St, Chelyabinsk, 454001

Alexandra L. Burmistrova

Chelyabinsk State University

Email: burmal@csu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6462-9500

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Microbiology, Immunology and General Biology, Faculty of Biology

Russian Federation, 129 Bratiev Kashirinykh St, Chelyabinsk, 454001

References

Supplementary files