Killer cell cluster immunity state in adult patients with common variable immunodeficiency

Full Text

Исследование было выполнено на следующих базах: кафедра клинической лабораторной диагностики, аллергологии и иммунологии УО «Гомельский государственный медицинский университет» (ректор – д.м.н., доцент И.О. Стома); лаборатория клеточных технологий (заведующий лабораторией Н.И. Шевченко) и отделение иммунопатологии и аллергологии (заведующий отделением – к.б.н. А.П. Саливончик) ГУ «Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека» (директор – д.м.н., доцент А.В. Рожко).

Введение

Общая вариабельная иммунологическая недостаточность (ОВИН) является наиболее частым первичным иммунодефицитом у взрослых [2, 6, 7]. Заболевание сопряжено с многочисленными изменениями параметров гуморального и клеточного иммунитета, включая, кроме нарушения дифференцировки В-лимфоцитов, различные количественные и функциональные дефекты Т-клеток и естественных киллеров. Так, продемонстрировано увеличение количества Т-цитотоксических лимфоцитов в крови пациентов на фоне снижения содержания Т-хелперов, Т-лимфоцитов памяти и регуляторных Т-клеток (Treg), повышение экспрессии молекул ранней и поздней активации на Т-лимфоцитах [1, 3, 10].

Известно, что клетки киллерного кластера, помимо непосредственного цитолитического действия, играют важную роль в регуляции механизмов естественной и специфической реактивности иммунной системы, которая осуществляется через рецепторные взаимодействия, секрецию цитокинов (TNFα, IFNγ, IL-10, IL-3, IL-8), хемокинов (MIP-1α/β, RANTES, CCL22, XCL1, CXCL8), ростовых факторов (GM-CSF, G-CSF) [6, 8, 9]. Участие цитотоксических субпопуляций лимфоцитов в противоинфекционном и противоопухолевом иммунитете, а также в формировании хронического воспаления предполагает их важную роль в развитии таких серьезных осложнений первичных гуморальных иммунодефицитов, как аутоиммунный синдром и опухолевые заболевания.

Цель работы – охарактеризовать состояние киллерного звена лимфоцитов и установить взаимосвязь с клиническими фенотипами у пациентов с общей вариабельной иммунологической недостаточностью.

Материалы и методы

Проведен ретроспективный анализ клинико-иммунологических параметров 30 пациентов (12 мужчин и 18 женщин) с установленным диагнозом ОВИН. Средний возраст пациентов составил 37,5±12,3 года. Все пациенты наблюдались в отделении иммунопатологии и аллергологии Государственного учреждения «Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека» (г. Гомель, Республика Беларусь). Диагноз верифицирован на основании клинико-лабораторных критериев, разработанных Европейским обществом по иммунодефицитам (European Society for Immunodeficiencies, Common Variable Immunodeficiency diagnostic criteria, 2020) [6].

У всех пациентов имелись в анамнезе инфекционные проявления вирусной и бактериальной природы: рецидивирующие инфекции ЛОР-органов – 30 человек (100%), пневмонии – 18 пациентов (60%), причем у 7 человек в сочетании с бронхоэктатической болезнью. Поражения кожи в виде пиодермии, дерматита, опоясывающего лишая наблюдались в 10 случаях (33,3%). У 11 пациентов (36,7%) инфекционный синдром (ИС) сочетался с аутоиммунным синдромом (АИС) в виде наличия таких проявлений, как аутоиммунная цитопения, ревматоидный артрит, аутоиммунный тиреоидит, алопеция. В 6 (20%) случаях наблюдались проявления лимфопролиферативного синдрома (ЛПС): увеличение периферических лимфатических узлов, лимфоидная гиперплазия кишечника, спленомегалия. Различные формы поражения желудочно-кишечного тракта (гастродуоденит, синдром раздраженного кишечника, хронический энтероколит, илеит) были выявлены в 16 случаях (53,3%). У 4 пациентов имелись злокачественные новообразования: аденокарцинома желудка (1 случай), лимфома (3 случая). Обследование пациентов с ОВИН проводилось в период очевидного отсутствия инфекционно-воспалительных заболеваний. Образцы крови забирались перед ежемесячным введением препаратов иммуноглобулинов.

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови идентифицировали на проточном цитофлуориметре BD FACS Canto II (США) с использованием наборов моноклональных антител линии IOTest фирм Beckman Coulter (France) и Becton Dickinson and Company (США), конъюгированных с флюорохромами. Содержание клеток киллерного кластера идентифицировали по экспрессии антигенов CD3⁺CD8⁺ (Т-киллеры), CD3^-CD16⁺CD56⁺ (NK-клетки), CD3⁺CD16⁺CD56⁺ (NKT-лимфоциты), CD3⁺CD8⁺CD45RО⁺ (Т-киллеры памяти), CD3⁺CD8⁺CD38⁺ (активированные цитотоксические Т-лимфоциты). Дополнительно определяли субпопуляцию лимфоцитов CD19⁺IgD^-CD27⁺ (IgD-переключенные В-лимфоциты памяти), которая, как известно, используется как дополнительный диагностически значимый лабораторный критерий ОВИН [1, 2, 3, 7]. Содержание сывороточных иммуноглобулинов А, М, G оценивали иммунотурбидиметрическим методом на автоматическом биохимическом анализаторе Architec C8000.

Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с когортой пациентов и не имеющих клинико-лабораторных признаков иммунологической недостаточности. Клиническое исследование выполнено в соответствии этическими принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (64^th WMA General Assembly, Fortaleza, Brazil, October, 2013)

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакетов прикладных программ StatSoft Statistica 13.0 (Trial-версия) и GraphPad Prism версии 9. Нормальность распределения числовых признаков проводилась с использованием критерия Shapiro-Wilk test. Принимая во внимание, что распределение числовых значений отличалось от закона нормального распределения, результаты исследования представлялись в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q_0,25-Q_0,75). Проверка достоверности различий непараметрически распределенных величин производилась с использованием U-критерия Манна–Уитни. Для проведения корреляционного анализа использовался критерий Спирмена (r: коэффициент корреляции). Критический уровень нулевой гипотезы принимался при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Выявлено, что медианные значения содержания в крови пациентов с ОВИН лимфоцитов с киллерными функциями изменялись неоднозначно. Так, количество NK-лимфоцитов (CD3^-CD16⁺CD56⁺) снижалось (p_% = 0,009, p_абс = 0,03), тогда как содержание Т-киллеров и NKT-клеток, напротив, было повышенным в сравнении с контрольной группой (p_%, < 0,001, p_абс = 0,004 и p_% = 0,02, p_абс = 0,009 соответственно) (рис. 1).

 

Рисунок 1. Содержание субпопуляций киллерных клеток у пациентов с ОВИН

Примечание. $●$– контрольная группа, n = 30. $⎔$– пациенты с ОВИН, n = 30.

Figure 1. Contents of killer cell subpopulations in patients with CVID

Note. $●$- control group, n = 30. , $⎔$-patients with CVID, n = 30.

 

Относительное количество циркулирующих NK-клеток было сопряжено с содержанием Т-цитотоксических лимфоцитов (r_s% = -0,545, p = 0,03), но не NKT-лимфоцитов. В то же время у здоровых лиц с содержанием Т-киллеров достоверно коррелировали именно NKT (r_s% = 0,517, p = 0,003), а не NK-лимфоциты.

Дефицит NK-лимфоцитов описан рядом авторов у пациентов с ОВИН и рассматривается как возможная причина их повышенной чувствительности к онкологическим заболеваниям [4, 5]. Тем не менее при индивидуальном анализе содержания NK-клеток в крови обследованных нами пациентов истощение пула NK (ниже нижней границы референтного диапазона) отмечалось только у 13 пациентов (43%; медианные значения 5,7% (4,5-7,4)). У остальных 17 человек (57%) содержание CD3^-CD16⁺CD56⁺ лимфоцитов находилось в пределах референтного диапазона здоровых лиц, хотя и тяготело к нижней границе нормы (медианные значения 12,6 % (11,4-17,7)).

Аналогичная неоднородность обнаруживалась и при анализе изменений количества Т-киллеров (CD3⁺CD8⁺). Увеличение относительного и абсолютного содержания CD8⁺ Т-лимфоцитов в сравнении с контрольной группой обнаруживалось в 76,7% случаев (n = 23), что приводило к повышенным медианным значениям этих показателей у пациентов (36,8 % (30,2-47,7) vs 22,6% (19,6-25,5); 0,62 × 10⁹ (0,43-0,88) vs 0,43 × 10⁹ (0,35-0,56) (рис. 1). Только в данной подгруппе пациентов количество Т-киллеров было сопряжено с содержанием NK-клеток (CD3^-CD16⁺CD56⁺) и CD3⁺CD8⁺CD45RО⁺ (Т-киллеры памяти) (r_s% = -0,545, p = 0,03; r_s% = 0,612, p = 0,009 соответственно). У 7 пациентов (23,3%) количество Т-киллеров в крови не выходило за пределы референтных значений, и описанные корреляции становились статистически не значимыми.

Повышение содержания CD3⁺CD8⁺ лимфоцитов в периферической крови пациентов с ОВИН описано и другими исследователями [2, 3, 10]. Увеличение цитотоксического потенциала Т-лимфоцитов может быть связано с повышением количества терминально дифференцированных стареющих Т-клеток (CD45RО⁺) на фоне истощения наивных Т-лимфоцитов (CD45RA⁺, CCR7⁺) в условиях длительной антигенной стимуляции, что в некоторой степени подтверждается и нашими исследованиями. Эффекторные Т-клетки памяти, как известно, имеют повышенную экспрессию IFNγ, перфорина и гранзима А и обладают высоким цитотоксическим потенциалом, что может способствовать формированию аутоиммунного воспаления.

Медианные значения содержания NKT-клеток (CD3⁺CD16⁺CD56⁺) у пациентов с ОВИН оказались выше значений здоровых лиц (5,9% (2,8-9,3) vs 3,9% (2,6-5,1)). Известно, что NKT-клетки – это минорная субпопуляция лимфоцитов, одновременно экспрессирующих маркеры Т-лимфоцитов (CD3, TCRαβ), и естественных киллеров (CD16, CD56). По современным данным, CD3⁺CD16⁺CD56⁺ лимфоциты повышают активность иммунокомпетентных клеток при поражении организма вирусами и бактериями путем быстрого высвобождения смешанного профиля цитокинов Th1/Th2 (IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IFNγ, TNFα) и, следовательно, иммунореактивность в целом. С другой стороны, при длительной хронической антигенной стимуляции (например аутоиммунных реакциях и опухолях) NKT-клетки проявляют преимущественно иммуносупрессивные свойства, индуцируя анергию Т-лимфоцитов и предотвращая чрезмерное повреждение тканей [8, 9, 10]. В наших исследованиях у пациентов с максимальными значениями CD3⁺CD16⁺CD56⁺ лимфоцитов выявлены отрицательные корреляции с содержанием Т-киллеров (CD3⁺CD8⁺; r_s% = -0,684, p = 0,007) и количеством активированных Т-киллеров (CD3⁺CD8⁺CD38⁺; r_s% = -0,853, p < 0,001). Это может свидетельствовать, что при ОВИН преобладающей является именно супрессорная активность данной субпопуляции клеток.

Интерес исследователей в настоящее время вызывает субпопуляция лимфоцитов с фенотипом CD3^-CD8⁺. Предполагается, что это активированные NK с более высоким сродством к клеткам-мишеням [5]. У пациентов с ОВИН наблюдалось снижение количества CD3^-CD8⁺ лимфоцитов в периферической крови относительно контрольной группы (1,7% (1,2-2,5) vs 6,4 % (5,2-8,3)). При этом следует отметить, что, в отличие от классических NK-лимфоцитов и Т-киллеров, лимфопения по CD3^-CD8⁺ клеткам наблюдалась практически у всех пациентов (в 93,3% случаев). Количество CD3^-CD8⁺ клеток коррелировало с содержанием NK-клеток (r_s% = 0,481, p = 0,008), NKT-лимфоцитов (r_s% = 0,427, p = 0,02), активированных Т-киллеров (CD3⁺CD8⁺CD38⁺; r_s% = -0,376, p = 0,04) и содержанием изотип-переключенных В-клеток памяти (CD19⁺IgD^-CD27⁺, r_s% = 0,39, p = 0,02). Известно, что сокращение пула CD19⁺IgD^-CD27⁺ лимфоцитов рассматривается как один из патогенетически значимых признаков ОВИН и является отражением нарушения антиген-зависимой дифференцировки В-лимфоцитов на этапе их превращения в плазматические клетки [1, 2, 3, 7]. Возможно, минорная субпопуляция лимфоцитов с фенотипом CD3^-CD8⁺ также участвует в регуляции процессов переключения В-клеток.

Таким образом, у пациентов с ОВИН продемонстрированы выраженные изменения количественного состава субпопуляций лимфоцитов киллерного кластера. При их сопоставлении с клиническими особенностями заболевания выявлено, что максимальные сдвиги параметров наблюдались у пациентов с сочетанным клиническим фенотипом «ИС+АИС+энтеропатия» (n = 6). В сравнении с пациентами с фенотипом «ИС+АИС» в этой группе отмечалась максимальная степень снижения количества NK-лимфоцитов и СD3^-CD8⁺ клеток (р = 0,02 и р = 0,04 соответственно) на фоне повышения содержания NKТ-клеток (р = 0,001) и значительного увеличения числа активированных Т-киллеров (CD3⁺CD8⁺CD38⁺; р = 0,009). У пациентов с клиническим фенотипом «ИC+АИС» в отличие от пациентов только с инфекционным синдромом также наблюдалось более выраженное снижение NК-клеток (р = 0,007), тогда как по другим изученным киллерным субпопуляциям различий не выявлялось.

Также нами установлено, что у пациентов с ОВИН и ЛПС (6 человек) по сравнению с пациентами, не имеющими симптомов лимфопролиферации (24 пациента) содержание NK-клеток оказалось более низким (6,7% (4,9-10,2) vs 11,7% (7,4-17,1), р = 0,04).

Полученные результаты свидетельствуют, что выраженные изменения субпопуляций киллерных клеток в виде лимфопении NK-клеток и CD3^-CD8⁺ лимфоцитов на фоне повышения количества NKT-лимфоцитов и Т-цитотоксических клеток связаны с более тяжелыми фенотипами ОВИН и прежде всего с развитием аутоиммунных процессов.

Выводы

1. У пациентов с ОВИН снижено содержание в периферической крови NK-клеток и СD3^-CD8⁺ лимфоцитов (p_% = 0,009, p_абс = 0,03 и p_%, _абс < 0,001) с одновременным повышением количества Т-киллеров и NKT-лимфоцитов (p_% = 0,02, p_абс = 0,009 и p_%, < 0,001, p_абс = 0,004 соответственно).
2. Выраженная лимфопения NK-клеток обратно взаимосвязана с количеством Т-киллеров (СD3⁺CD8⁺; r_s% = -0,545, p = 0,03), активированных Т-цитотоксических лимфоцитов (CD3⁺CD8⁺CD38⁺; r_s% = -0,38, p = 0,04) и прямо коррелирует с численностью CD3^-CD8⁺ клеток (r_s% = 0,481, p = 0,008).
3. Установлена взаимосвязь параметров киллерного кластера лимфоцитов (CD3^-CD16⁺CD56⁺, СD3^-CD8⁺, СD3⁺CD8⁺, CD3⁺CD16⁺CD56⁺) с тяжестью клинических проявлений ОВИН. Максимально выраженные изменения киллерных субпопуляций отмечены у пациентов с сочетанным клиническим фенотипом «инфекционный синдром + аутоиммунный синдром» и «инфекционный синдром + аутоиммунный синдром + энтеропатия».

About the authors

Svetlana S. Prokopovich

Gomel State Medical University

Email: prokopovich.s1983@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3329-911X

Assistant Professor, Department of Clinical Laboratory Diagnostics, Allergology and Immunology

Belarus, 246038, Gomel, Sviridov str., 61, apt 29

I. A. Novikova

Gomel State Medical University

Author for correspondence.
Email: ir-nov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2250-8318

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Clinical Laboratory Diagnostics, Allergology and Immunology

Belarus, 246038, Gomel, Sviridov str., 61, apt 29

References

Supplementary files