Email this article Analysis of regulatory T lymphocytes in patients with traumatic brain injury
- Authors: Norka A.O.1,2, Vorobyev S.V.3, Kuznetsova R.N.1,2, Serebriakova M.K.4, Kudryavtsev I.V.1,5, Kovalenko S.N.4, Monashenko D.N.6
-
Affiliations:
- First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University
- Saint Petersburg Pasteur Institute
- V. Almazov National Medical Research Centre
- S. Kirov Military Medical Academy
- Institute of Experimental Medicine
- St. Petersburg City Hospital No. 26, St. Petersburg
- Issue: Vol 26, No 4 (2023)
- Pages: 587-592
- Section: Forum Sochi 2023
- Submitted: 10.07.2023
- Accepted: 12.07.2023
- Published: 22.09.2023
- URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/13981
- DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-13981-AOR
- ID: 13981
Cite item
Full Text
Abstract
In recent years, traumatic brain injury (TBI) has been one of the most urgent medical and social problems due to its prevalence, predominantly affecting young people of working age, causing high mortality, disability and economic costs for treatment and subsequent rehabilitation of patients. At present, the role of patients’ immune system in evolving neuroinflammation after traumatic brain injury has been proven. Treg cell populations represent an important factor determining the outcome of the disease due to promoting induction of immunological tolerance, being a significant component of immunoregulation. As a result of our study, we found a decrease in the relative content of Treg within the total lymphocyte pool of peripheral blood, which has the CD3+CD4+CD25bright phenotype in patients of the 3rd and 4th groups, in comparison with the data from control group. Moreover, a decreased relative content of Tregs (CD4+CD25+T cells) was revealed which is due to the degree of brain tissue damage and, as a result, their migration to suppress inflammation due to production of anti-inflammatory cytokines (TGF-â, IL-10). The Treg population is heterogeneous, thus prompting us for analysis of the Treg subpopulations profile based on the expression of CD45R0 and CD62L. When assessing subpopulations of regulatory T lymphocytes within CD45Ro and CD62L, significant changes were found only in patients with brain contusion. The changes were revealed within the pool of “naive” T regulatory lymphocytes with the CD3+CD4+CD25brightCD39+ Treg phenotype, capable of producing a wide range of cytokines specific for Th1, Th2, Th17, in patients with mild, moderate and severe TBI. Meanwhile, the level of highly active CD3+CD4+CD25brightCD73+ Tregs was significantly reduced in patients with moderate and severe TBI. These changes indicate an imbalance in immunoregulatory processes resulting from extensive damage to brain tissues.
Full Text
Введение
Черепно-мозговая травма (ЧМТ) является одной из наиболее актуальных медицинских и социальных проблем и относится к числу наиболее часто встречаемых форм патологии неврологического профиля. Частота ее возникновения достигает 100-749 человек в расчете на 100 тысяч населения [4, 9]. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), среди всех травматических повреждений ЧМТ характеризуется высоким уровнем летального исхода и инвалидизации (30-77%) [4], а гетерогенность вариантов предопределяет возникновение трудностей в оценке степени тяжести и прогнозировании раннего исхода заболевания.
При этом в последние годы доказано участие иммунной системы организма в развитии нейровоспалительного процесса в ответ на травматическое и другое повреждение мозга [5, 6]. Воспаление играет ключевую роль в патогенезе травматической болезни. Клетки иммунной системы вовлечены на всех стадиях нейровоспалительного каскада, начиная от процессов повреждения и репарации. При этом ключевой популяцией, обладающей супрессивной активностью, тем самым защищая нервную ткань от травматического повреждения, обладает популяция Treg [8].
Treg секретируют цитокины с противовоспалительной активностью (IL-10, TGF-β), ингибируют активность субпопуляций Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток локально и на периферии. Так, усиление активности Treg приводит к уменьшению размеров поражения нервной ткани [7]. Протективный эффект Treg обусловлен как подавлением нейровоспалительного процесса, так и усиление нейрогенеза путем стимуляции процессов посттравматической неоваскуляризации.
Таким образом, одним из ключевых механизмов сдерживания гиперактивных иммунологических ответов после травматического повреждения головного мозга является активация FoxP3+Treg. Однако в настоящее время, несмотря на накопленный объем знаний, не существует oкoнчательной парадигмы o вовлечении субпoпуляций FoxP3+Treg в иммунопатогенезе травматической болезни в остром периоде.
Целью исследования является изучение роли регуляторных Т-лимфоцитов в пaтогенезе черепно-мозговой травмы различной степени тяжести.
Материалы и методы
Объектом исследования служила венозная кровь больных с ЧМТ различной степени тяжести (n = 110) в возрасте от 20 до 55 лет. Согласно международной классификации, все пациенты были разделены на 4 группы [3]: 1-я группа – больные с сотрясением головного мозга (СТГ); 2-я группа – с ушибом головного мозга легкой степени тяжести (УЛС); 3-я группа – с ушибом головного мозга средней степени тяжести (УСС); 4-я группа – с ушибом тяжелой степени тяжести (УТС). В контрольную группу вошли 48 практически здоровых лиц (женщины – 26 человек, мужчины – 22 человека) в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст 42,3±11,3 года), которые были донорами отделения переливания крови Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени акад. И.П. Павлова.
С целью оценки субпопуляционного состава регуляторных Т-лимфоцитов собирались образцы венозной крови в вaкуумные пробирки с содержанием K3ЭДТА. Все исследования проводились в день взятия крови. Подготовку образцов периферической крови и нaстройку проточного цитофлуориметра проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными Байдун и соавторами [1]. Для выявления основных cубпопуляций Т-лимфоцитов и оценки уровня экспрессии ими CD39 и CD73 применялась панель моноклональных антител. К образцам периферической крови пациентов (100 мкл) вносили АТ в соответствии с рекомендациями производителя, после чего инкубировали 15 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте [2]. Удаление эритроцитов из образцов проводили по безотмывочной технологии с использованием лизирующего раствора VersaLyse, к 975 мкл которого ex tempora добавляли 25 мкл фиксирующего раствора IOTest 3 Fixative Solution, методом проточной цитофлуориметрии с использованием диагностического прибора Navios (Beckman Coulter, США), оснащенного тремя лазерам с длинами волн излучения 405, 488 и 638 нм. Обработка данных проводилась с использованием программ: Navios Software v.1.2, KaluzaTM v. 2.0 (Beckman Coulter, США). Результаты содержания лимфоцитов представлены в виде: % – процента содержания от общего числа лимфоцитов или исследуемой популяции лимфоцитов; абсолютного (кл/ мкл, количество клеток в 1 мкл периферической крови) числа лимфоцитов. Статистическую обработку проводили при помощи программного обеспечения GraphPad Prism 6.00 (GraphPad Prism for Mac, США). Результаты были выражены в виде медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (Q0,25-Q0,75). Для сравнения парных количественных значений полученных выборок использовали непараметрический критерий Манна–Уитни.
Результаты и обсуждение
По результатам исследования относительного содержания Тreg в рамках общего лимфоцитарного пула, имеющих фенотип CD3+CD4+CD25bright, в периферической крови выявлен пониженный уровень: c 3,3% (2,8-3,8) до 2,8% (2,5-3,3) у пациентов в 3-й (УСС) и до 2,6% (2,0-3,3) в 4-й группе (УТС), что логично согласуется с концепцией о перераспределении и последующей миграции клеток эффекторов в очаг воспаления.
Необходимо отметить, что популяция Тreg неоднородна, поэтому в рамках исследования был проведен анализ распределения Тreg по субпопуляциям, выявленным на основании экспрессии CD45RO и CD62L.
При оценке субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов в рамках CD45RO и CD62L были установлены значимые изменения только у пациентов с ушибом головного мозга. Это свидетельствует о том, что, возможно, степень тяжести травмы обуславливает степень активации Тreg. Проведенный анализ показал достоверно пониженный уровень относительного количества «наивных» Тreg: 19,8% (13,0-32,4) при р = 0,008 во 2-й группе (УЛС), 21,1% (14,0-29,0) при р = 0,002 в 3-й группе (УСС) и 14,9% (12,4-30,0) при р = 0,0004 в 4-й группе (УТС) против 32,4% (26,6-37,8). Схожие изменения были выявлены в рамках абсолютных значений в виде пониженного уровня у всех пацентов с ушибом головного мозга (p < 0,05). При этом Тreg «эффекторной памяти» имели достоверно повышенный относительный уровень в 3-й (УСС) (р = 0,003) и 4-й группах (УТС): 63,3% (63,0-81,6) при р = 0,003 и 61,7% (53,5-73,4) при р = 0,016, соответственно, против 55,5% (47,7-59,6). Абсолютное содержание также было повышено в 3-й (УСС) (р = 0,013) и 4-й группах (УТС) (р = 0,033): 5,4 кл/мкл (2,4-6,4) при р = 0,013 и 4,2 кл/мкл (2,42,8-7,4) при р = 0,033, соответственно, против 8,8 кл/мкл (4,4-9,2). Достоверных изменений абсолютного и относительного количества Тreg «центральной памяти» обнаружено не было (р > 0,05) ни в одной из обследованных групп. Результаты приведены в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1. ОТНОСИТЕЛЬНОЕ И АБСОЛЮТНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ С ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМОЙ, НАХОДЯЩИХСЯ НА РАЗЛИЧНЫХ СТАДИЯХ СОЗРЕВАНИЯ, Me (Q0,25-Q0,75)
TABLE 1. RELATIVE AND THE ABSOLUTE NUMBER OF REGULATORY T CELL SUBSETS IN PERIPHERAL BLOOD FROM PATIENTS WITH TRAUMATIC BRAIN INJURY, Me (Q0.25-Q0.75)
Популяция Тreg Treg population | Фенотип Phenotype | Группа 1 Group 1 | Группа 2 Group 2 | Группа 3 Group 3 | Группа 4 Group 4 | Группа 5 Group 5 | р | |
«Наивные» Тreg "Naive" Treg | CD45RO-CD62L+ | % | 26,7 (20,7- 37,8) | 19,8 (13,0- 32,4) | 21,1 (14,0- 29,0) | 14,9 (12,4- 30,0) | 32,4 (26,6- 37,8) | р1-4 = 0,005 р2-5 = 0,008 р3-5 = 0,002 р4-5 = 0,0004 |
кл/мл cell/mL | 13,6 (3,6- 22,4) | 4,8 (2,8- 16,5) | 8,6 (3,8- 15,4) | 7,9 (3,8- 13,6) | 19,0 (12,8- 25,5) | р1-2 = 0,024 р2-5 = 0,001 р3-5 = 0,007 р4-5 = 0,001 | ||
Тreg центральной памяти Central memory Treg | CD45RO+CD62L+ | % | 57,9 (53,8- 65,0) | 61,1 (49,0- 76,0) | 63,3 (37,0- 74,0) | 61,7 (53,0- 73,4) | 55,5 (48,0- 59,6) | |
кл/мл cell/mL | 29,0 (21,5- 33,2) | 23,1 (15,3- 38,1) | 17,2 (12,8- 36,7) | 21,3 (11,5- 42,1) | 29,0 (24,8- 45,0) | |||
Тreg эффекторной памяти Effector memory Treg | CD45RO+CD62L- | % | 57,9 (53,8- 65,0) | 61,1 (49,0- 76,0) | 63,3 (63,0- 81,6) | 61,7 (53,5- 73,4) | 55,5 (47,7- 59,6) | р1-3 = 0,015 р3-5 = 0,03 р4-5 = 0,016 |
кл/мл cell/mL | 4,8 (2,5- 15,5) | 3,8 (2,8- 11,9) | 5,4 (2,4- 6,4) | 4,2 (2,8- 7,4) | 8,8 (4,4- 9,2) | р3-5 = 0,013 р4-5 = 0,033 | ||
Примечание. % – процент содержания от общей популяции регуляторных Т-лимфоцитов; группа 1 – сотрясение головного мозга; группа 2 – ушиб легкой степени тяжести; группа 3 – ушиб средней степени тяжести; группа 4 – ушиб тяжёлой степени тяжести; группа 5 – контрольная группа; p1-2, p1-3, p1-4, p1-5, p2-3, p2-4, p2-5, p3-4, p3-5, p4-5 – различия между соответствующими группами.
Note. % Tregs out of total lymphocyte count; group 1 – concussion; group 2 – mild brain contusion; group 3 – moderate brain contusion; group 4 – severe brain contusion; group 5 – control group; p1-2, p1-3, p1-4, p1-5, p2-3, p2-4, p2-5, p3-4, p3-5, p4-5 – differences between the respective groups.
Не менее важным является анализ, основанный на уровне экспрессии CD39 и CD73 (2 основные нуклеотидазы, осуществляющие расщепление АТФ до АДФ, пирофосвата и АМФ, а также аденозина и фосфата соответственно). Так, были проанализированы субпопуляции Тreg, ко-экспрессирующие CD39 или CD73 на мембранах. Среди «наивных» Тreg был выявлен повышенный уровень CD39-позитивных лимфоцитов: 0,2% (0,02-0,4) при р = 0,015 во 2-й (УЛС), 0,2% (0,01-0,7) при р = 0,027 в 3-й (УСС) и 0,09% (0,01-0,3) при р = 0,006 в 4-й группах (УТС) против 0,7% (0,2-1,2). Относительное содержание «наивных» Тreg, экспрессирующих CD73, было установлено повышенное содержание в 3-й (УСС) и 4-й группах (УТС): 1,3% (0,2-3,7) при р = 0,022 и 1,5% (0,002-5,1) при р = 0,048, соответственно, против 4,2% (2,6-5,5). Результаты приведены в таблице 2.
ТАБЛИЦА 2. СОДЕРЖАНИЕ CD39- И CD73- ПОЗИТИВНЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ У ПАЦИЕНТОВ С ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМОЙ, Me (Q0,25-Q0,75)
TABLE 2. RELATIVE NUMBER OF REGULATORY T CELL SUBSETS IN PERIPHERAL BLOOD FROM PATIENTS WITH TRAUMATIC BRAIN INJURY, Me (Q0.25-Q0.75)
Популяция Тreg Treg population | Фенотип Phenotype | Группа 1 Group 1 | Группа 2 Group 2 | Группа 3 Group 3 | Группа 4 Group 4 | Группа 5 Group 5 | р | |
CD39-позитивные регуляторные Т-лимфоциты CD39-positive regulatory T cells | ||||||||
«Наивные» Тreg "Naive" Treg | CD45RO-CD62L+ | % | 0,6 (0,2- 1,3) | 0,2 (0,02- 0,40) | 0,2 (0,01- 0,70) | 0,09 (0,01- 0,30) | 0,7 (0,2- 1,2) | р1-3 = 0,027 р1-4 = 0,0433 р2-5 = 0,015 р3-5 = 0,027 р4-5 = 0,0006 |
Тreg центральной памяти Central memory Treg | CD45RO+CD62L+ | % | 1,7 (0,3- 1,7) | 1,6 (0,8- 1,6) | 1,0 (0,3- 1,9) | 0,7 (0,5- 2,3) | 1,9 (0,5- 2,7) | |
Тreg эффекторной памяти Effector memory Treg | CD45RO+CD62L- | % | 57,9 (53,8- 65,0) | 61,1 (49,0- 76,0) | 63,3 (63,0- 81,6) | 61,7 (53,5- 73,4) | 55,5 (47,7- 59,6) | |
CD73-позитивные регуляторные Т-лимфоциты CD73-positive regulatory T cells | ||||||||
«Наивные» Тreg "Naive" Treg | CD45RO-CD62L+ | % | 2,6 (1,3- 6,2) | 2,4 (0,9- 6,1) | 1,3 (0,2- 3,7) | 1,5 (0,002- 5,100) | 4,2 (2,6- 5,5) | р3-5 = 0,002 р4-5 = 0,048 |
Тreg центральной памяти Central memory Treg | CD45RO+CD62L+ | % | 1,7 (0,8- 3,6) | 2,2 (0,9- 3,0) | 2,0 (0,7- 4,7) | 3,4 (1,1- 5,6) | 2,3 (1,4- 3,9) | |
Тreg эффекторной памяти Effector memory Treg | CD45RO+CD62L- | % | 3,9 (1,6- 6,8) | 3,4 (1,3- 4,7) | 2,3 (0,6- 5,3) | 1,8 (0,9- 5,4) | 2,5 (1,6- 4,2) | |
Примечание. % – процент содержания среди субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов: «наивные» Treg (CD45RO-CD62L+), Treg центральной памяти (CD45RO+CD62L+) и Treg эффекторной памяти (CD45RO+CD62L-); группа 1 – сотрясение головного мозга; группа 2 – ушиб легкой степени тяжести; группа 3 – ушиб средней степени тяжести; группа 4 – ушиб тяжёлой степени тяжести; группа 5 – контрольная группа.
Note. % Tregs out of total lymphocyte count: naive Tregs (CD45R0-CD62L+), central memory Tregs (CD45R0+CD62L+), effector memory Tregs (CD45RO+CD62L–); group 1 – concussion; group 2 – mild brain contusion; group 3 – moderate brain contusion; group 4 – severe brain contusion; group 5 – control group.
Заключение
Повышенный уровень CD39-позитивных лимфоцитов у пациентов с ушибом головного различной степени тяжести связан с механизмами иммуносупрессии за счет их способности к миграции в воспаленную ткань и последующим синтезом противовоспалительного аденозина, оказывающего супрессивное действие на клетки врожденного (в т. ч. активированной микроглии) и адаптивного иммунитета, что важно для ограничения процессов, направленных на вторичное повреждение ткани.
About the authors
Anna O. Norka
First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University; Saint Petersburg Pasteur Institute
Email: norka-anna@mail.ru
Senior Laboratory Assistant, Department of Immunology, First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University; Neurologist, Medical Centre, St. Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology
Russian Federation, St. Petersburg; St. PetersburgS. V. Vorobyev
V. Almazov National Medical Research Centre
Email: norka-anna@mail.ru
PhD, MD (Medicine), Chief Research Associate, Research Laboratory of Neurology and Neurorehabilitation, V. Almazov National Medical Research Centre
Russian Federation, St. PetersburgR. N. Kuznetsova
First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University; Saint Petersburg Pasteur Institute
Email: norka-anna@mail.ru
PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Immunology, First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University; Allergist-Immunologist, Medical Centre, St. Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology
Russian Federation, St. Petersburg; St. PetersburgM. K. Serebriakova
S. Kirov Military Medical Academy
Email: norka-anna@mail.ru
Postgraduate Student, Research Associate, Department of Immunology, Institute of Experimental Medicine
Russian Federation, St. PetersburgI. V. Kudryavtsev
First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University; Institute of Experimental Medicine
Author for correspondence.
Email: norka-anna@mail.ru
PhD (Biology), Senior Research Associate, Department of Immunology, Institute of Experimental Medicine; Associate Professor, Department of Immunology, First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University
Russian Federation, St. Petersburg; St. PetersburgS. N. Kovalenko
S. Kirov Military Medical Academy
Email: norka-anna@mail.ru
Lecturer, Department of Neurosurgery, S. Kirov Military Medical Academy
Russian Federation, St. PetersburgD. N. Monashenko
St. Petersburg City Hospital No. 26, St. Petersburg
Email: norka-anna@mail.ru
PhD (Medicine), Neurosurgeon, St. Petersburg City Hospital No. 26
Russian Federation, St. PetersburgReferences
- Байдун Л.А., Зурочка А.В., Хайдуков С.В., Тотолян Арег А. Стандартизованная технология «Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов» (проект) // Медицинская иммунология, 2012. Т. 14, № 3. С. 255-268. [Baidun L.A., Zurochka A.V., Khaidukov S.V., Totolian Areg A. Methods. Standardized technology “Study of the subpopulation composition of peripheral blood lymphocytes using flow cytofluorometer-analyzers” (draft). Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2012, Vol. 14, no. 3. pp. 255-268. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2012-3-255-268.
- Кудрявцев И.В., Субботовская А.И. Опыт измерения параметров иммунного статуса с использованием шестицветного цитофлуоримерического анализа // Медицинская иммунология, 2015. T. 17, № 1. С. 19-26. [Kudryavtsev I. V., Subbotovskaya A.I. Application of six-color flow cytometric analysis for immune profile monitoring. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2015, Vol. 17, no. 1, pp. 19-26. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2015-1-19-26.
- Лихтерман Л.Б. Черепно-мозговая травма. Диагностика и лечение. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. 488 с. [Likhterman L.B. Traumatic brain injury. Diagnosis and treatment]. Moscow. GEOTAR-Media, 2014. 488 pp.
- Сабиров Д.М., Росстальная А.Л., Махмудов М.А. Эпидемиологические особенности черепно-мозгового травматизма // Вестник экстренной медицины, 2019. № 2. С. 61-65. [Sabirov D.M., Rosstalnaya A.L., Makhmudov M.A. Epidemiological features of craniocerebral traumatism. Vestnik ekstrennoy meditsiny = Bulletin of Emergency Medicine, 2019, no. 2, pp. 61-65. (In Russ.)]
- Dantzer R., O’Connor J.C., Freund G.G., Johnson R.W., Kelley K.W. From inflammation to sickness and depression: when the immune system subjugates the brain. Nat. Rev. Neurosci., 2008, Vol. 9. no. 1, pp. 46-56. doi: 10.1038/nrn2297.
- Erickson M.A., Wilson M.L. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS, 2020, Vol. 17, no. 1, 26. doi: 10.1186/s12987-020-00187-3.
- Langeh U.U., Singh S. Targeting S100B protein as a surrogate biomarker and its role in various neurological disorders. Curr. Neuropharmacol., 2021, Vol. 9, no. 2, pp. 265-277.
- Nizamutdinov D., Shapiro L.A. Overview of traumatic brain injury: an immunological context overview of traumatic brain injury: an immunological context. Brain Sci., 2017, Vol. 7, no. 1, 11. doi: 10.3390/brainsci7010011.
- Peeters W.R., van den Brande R., Polinder S. Epidemiology of traumatic brain injury in Europe. Acta Neurochir. (Wien), 2015, Vol. 157, no. 10, pp. 1683-1696.
Supplementary files
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).