Features of the neutrophil granulocyte phenotype in children with infectious mononucleosis

Full Text

Введение

Инфекционный мононуклеоз (ИМ) – часто встречающаяся клиническая форма инфекции, преимущественно вызванная вирусом Эпштейна–Барр (ВЭБ), которая представляет собой неспецифическую клинически манифестную реакцию ретикулоэндотелиальной системы на инфекционный процесс. Вирус способен пожизненно персистировать в организме, осуществляя репликацию преимущественно в В-лимфоцитах [1, 17]. Такая персистенция ВЭБ приводит к возникновению иммунодефицитных состояний и является патогенетическим фоном для формирования контингента детей, подверженных повторным эпизодам респираторной патологии [1, 2, 9].

При ВЭБ-инфекции у детей может нарушаться функция не только В-лимфоцитов, но и таких клеток иммунной системы, как Т-лимфоциты, NK-клетки, нейтрофилы [3, 9]. Причем изменения реактивности клеток иммунной системы может осуществляться как за счет их инфицирования, так и опосредованными механизмами, например, через нарушения регуляторных процессов в иммунной системе. В частности, проведенными ранее исследованиями было показано, что у детей с ВЭБ-инфекцией в нейтрофилах крови нарушаются механизмы синтеза первичных и вторичных АФК, что влияет на развитие полноценной функциональной активности клеток [3].

В настоящее время все большее внимание привлекают исследования, связанные с ролью клеток врожденного иммунитета в иммунопатогенезе вирусных инфекций [8, 13]. Связано это с тем, что характер течения инфекционных заболеваний, вызванных вирусами, а зачастую и их исход, определяется активностью воспалительной реакции, которая реализуется как на местном, так и на системном уровне. Известно, что нейтрофильные гранулоциты вовлекаются в развитие любого иммуновоспалительного процесса [3, 4, 10]. Воспринимая многочисленные сигналы о дестабилизации внутренней среды, нейтрофилы модулируют свои функции, нацеленные на ее восстановление. Активированные нейтрофильные гранулоциты при этом становятся мощными эффекторами пусковых и регуляторных механизмов самых начальных этапов инфекционных заболеваний, определяющих характер развития воспалительных процессов. Уже как эффекторы нейтрофилы способны реализовать широкий спектр защитных реакций – фагоцитоз, формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек (neutrophil extracellular traps, NETs) и синтезировать и секретировать широкий спектр цитотоксических молекул (например, активных форм кислорода (АФК), лизосомальных ферментов и т. д.) [3, 4, 15]. В то же время, в связи с тем, что нейтрофильные гранулоциты способны синтезировать и в рамках реализации своих эффекторных функций выделять в окружающую среду различные цитокины, регулирующие функциональную активность других клеток иммунной системы, нейтрофилы определяются и как регуляторные клетки [4, 10]. При этом эффекторная и регуляторная активность нейтрофильных гранулоцитов значительно зависит от экспрессии соответствующих рецепторов на поверхности клетки. Причем изменения в уровнях экспрессии активационных рецепторов на нейтрофилах при развитии иммуновоспалительных процессов будут характеризовать роль клеток при данной патологии и уровень нарушения их функциональной активности [4, 7].

Таким образом, целью данного исследования явилось изучение особенностей фенотипического состава нейтрофилов крови у детей с ИМ.

Материалы и методы

На базе инфекционного отделения КГБУЗ «Красноярская межрайонная детская клиническая больница № 1» г. Красноярска обследовано 84 ребенка в возрасте от 3 до 11 лет с ВЭБ-инфекцией средней и тяжелой степени тяжести. В группу обследования не были включены дети с негладким течением ИМ (тяжелая нейтропения, тромбоцитопения и повышение аминотрансфераз более 5 норм) на фоне лечения противовирусными и антибактериальными препаратами и препаратами, обладающими иммуномодулирующим действием, а также больные с наличием другого инфекционного заболевания, перенесенного в течение последнего месяца перед включением в обследование, и при отказе в подписании информированного согласия на участие в клиническом исследовании. Все наблюдаемые нами пациенты имели положительный тест на ДНК ВЭБ в лимфоцитах крови и серологические маркеры острой ВЭБ-инфекции (ВЭБ-VCAIgM (+), ВЭБ-EA-DIgG (+)). Контрольную группу составили 40 практически здоровых детей аналогичного возрастного диапазона.

Исследование было одобрено комитетами по этике НИИ МПС и КрасГМУ, выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием человека» (с изменениями 2013 г.) и «Правилами надлежащей клинической практики в Российской Федерации», утвержденной приказом Минздрава России от 19 июня 2003 г. № 266.

Забор крови у обследуемых детей производили утром натощак с 8 до 9 часов. Цельную периферическую кровь забирали из локтевой вены в 4 мл вакутейнер с К₂ЭДТА. Исследование развернутого анализа крови и фенотипического состава нейтрофилов осуществляли в течение 2 часов после забора крови. Исследование содержания лейкоцитов и общей фракции нейтрофилов в крови осуществляли на гематологическом анализаторе DxH 500 (Beckman Coulter, США) центра коллективного пользования ФИЦ КНЦ СО РАН. Иммунофенотипирование нейтрофильных гранулоцитов проводили методом проточной цитометрии с использованием прямой иммунофлуоресценции цельной периферической крови с помощью моноклональных антител, меченных FITC (fluoresceinisothiocyanate); PE (phycoerythrin), PerCP/Cyanine 5.5 (peridinin-chlorophyll protein-cyanin 5.5), PC7 (phycoerythrin-cyanin 7), APC (allophycocyanin), AF700 (Alexa Fluor 700) и APC/Cyanine7 (allophycocyanin-cyanine7) (табл. 1). Пробоподготовку осуществляли по стандартной методике [20]. Лизис эритроцитов был выполнен по безотмывочной технологии с использованием реагента VersLyse (Beckman Coulter, США). Распределение антител по каналам флуоресценции проводили в соответствии с принципами формирования панелей для многоцветных цитофлуориметрических исследований [5]. Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США) Красноярского регионального центра коллективного пользования ФИЦ КНЦ СО РАН. Обработку полученных цитофлуориметрических результатов осуществляли с помощью программ Navios Software v. 1.2 и Kaluza v. 2.1.1 (Beckman Coulter, США).

 

Таблица 1. Клон белка, изотип, флуорохром и производитель моноклональных антител, используемых в исследовании

Table 1. Protein clone, isotype, fluorochrome and manufacturer of monoclonal antibodies used in the study

Антитело Antibody	Клон Clone	Изотип Isotype	Флуорохром Fluorochrome	Производство Production
CD64	22	Mouse IgG1	FITC	Beckman Coulter
CD32	FUN-2	Mouse IgG2b	PE	BioLegend
CD11b	LM2	Mouse IgG1	PerCP/Cyanine5.5	BioLegend
CD16	3G8	Mouse IgG1	PC7	Beckman Coulter
CD15	HI98	Mouse IgM	Alexa Fluor® 700	BioLegend
CD45	HI30	Mouse IgG1	APC/Cyanine7	BioLegend

 

Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильного размаха в виде 1-го и 3-го квартилей (Q_0,25-Q_0,75). Достоверность различий между показателями независимых выборок (сравнение с показателями контрольной группы) оценивали по непараметрическому U-критерию Манна–Уитни (Mann–Whitney U test). Статистический анализ осуществляли в пакете программ Statistica 6.1 (StatSoft Inc., США, 2007).

Результаты

Исследование содержания нейтрофилов в крови при ИМ позволило установить, что у больных детей в возрасте 3-6 лет снижается процентное количество общей фракции нейтрофильных гранулоцитов на фоне повышения абсолютного уровня лейкоцитов (табл. 2). При исследовании количества нейтрофильных гранулоцитов, экспрессирующих CD32 и CD64, установлено, что у детей в возрасте 3-6 лет с ИМ снижено относительное содержание CD64^-CD32⁺ нейтрофилов, но повышено количество CD64^-CD32^- и CD64⁺CD32^- клеток. У детей с ИМ данной возрастной группы обнаружены изменения в содержании нейтрофильных гранулоцитов в крови, экспрессирующих рецепторы CD64 и CD11b, относительно контрольных значений: повышение количества CD64⁺CD11b⁺ клеток, понижение уровня CD64⁺CD11b^- клеток. Проведение цитометрического анализа нейтрофилов, экспрессирующих пару рецепторов CD64 и CD15, позволило установить, что в первой возрастной группе больных ИМ снижается количество CD64^-CD15⁺ нейтрофилов, но значительно увеличивается содержание клеток отрицательных по CD15: CD64^-CD15^- и CD64⁺CD15^- клеток. При исследовании клеток с экспрессией рецепторов CD32 и CD11b обнаружено, что при ИМ у детей в возрасте 3-6 лет значительно повышается содержание CD32^-CD11b⁺ и CD32^-CD11b^- нейтрофилов, а также понижается уровень CD32⁺CD11b⁺ клеток. Кроме того, у детей в возрасте 3-6 лет с ИМ относительно контрольных значений в крови возрастает содержание CD11b^-CD15⁺, CD11b^-CD15^- и CD11b⁺CD15^- нейтрофилов, но снижается количество CD11b⁺CD15⁺ нейтрофилов.

 

Таблица 2. Фенотипический состав нейтрофилов крови (в %) у детей в возрасте 1-3 лет с инфекционным мононуклеозом, Ме (Q_0,25-Q_0,75)

Table 2. Phenotypic composition of blood neutrophils (in %) in children aged 1-3 years with infectious mononucleosis, Ме (Q_0.25-Q_0.75)

Показатели Indicators	Контроль Control	Больные ИМ Patients with IM	р
Лейкоциты, 109/л Leukocytes, 109/L	8,11 (6,12-10,25)	14,60 (10,30-18,35)	0,003
Нейтрофилы, % Neutrophils, %	53,2 (47,5-62,0)	36,0 (18,7-42,0)	< 0,001
Нейтрофилы, 109/л Neutrophils, 109/L	4,29 (2,93-6,39)	4,12 (2,15-6,77)
CD64-CD32+	95,56 (84,98-98,52)	45,63 (37,19-57,66)	< 0,001
CD64+CD32+	1,59 (0,69-2,92)	0,87 (0,30-1,97)
CD64-CD32-	5,89 (3,10-9,14)	51,62 (44,13-60,83)	< 0,001
CD64+CD32-	0,81 (0,02-2,12)	2,14 (1,76-3,09)	0,049
CD64-CD11b+	92,63 (84,97-97,45)	91,87 (85,04-98,12)
CD64+CD11b+	3,01 (1,79-5,45)	7,12 (5,63-10,02)	0,010
CD64-CD11b-	1,24 (0,65-4,42)	0,99 (0,50-1,97)
CD64+CD11b-	0,15 (0,006-0,200)	0,007 (0,003-0,010)	0,039
CD64-CD15+	95,79 (87,18-96,23)	58,22 (43,81-69,04)	< 0,001
CD64+CD15+	2,31 (1,38-3,33)	1,86 (1,05-3,11)
CD64-CD15-	2,25 (1,04-4,96)	37,63 (29,94-48,06)	< 0,001
CD64+CD15-	0,08 (0,01-0,50)	2,14 (1,27-4,00)	< 0,001
CD32-CD11b+	1,98 (1,10-3,56)	49,52 (41,24-58,63)	< 0,001
CD32+CD11b+	92,80 (83,72-98,34)	18,76 (10,28-27,33)	< 0,001
CD32-CD11b-	1,41 (0,76-2,26)	28,69 (19,87-36,52)	< 0,001
CD32+CD11b-	2,49 (1,07-3,93)	2,26 (1,15-4,04)
CD11b-CD15+	1,09 (0,28-3,42)	48,72 (40,84-58,14)	< 0,001
CD11b+CD15+	95,85 (92,64-97,91)	40,25 (34,67-49,19)	< 0,001
CD11b-CD15-	0,12 (0,10-0,99)	2,24 (0,84-3,71)	0,006
CD11b+CD15-	2,36 (0,45-3,39)	7,34 (3,77-12,08)	0,003

 

У детей в возрасте 7-11 лет с ИМ также (как и у больных в возрасте 3-6 лет) понижено процентное содержание нейтрофилов на фоне повышенного относительно контрольных значений абсолютного уровня лейкоцитов (табл. 3). При исследовании особенностей фенотипа нейтрофилов у детей в возрасте 7-11 лет установлено, что при ИМ значительно снижено процентное количество CD64^-CD32⁺ нейтрофилов, но при повышении содержания CD64^-CD32^- и CD64⁺CD32^- клеток. Кроме того, у больных детей данной возрастной группы в периферической крови повышено количество CD64⁺CD11b⁺ нейтрофилов относительно контрольных значений. Выраженные изменения относительно контрольных показателей обнаружены у детей с ИМ в содержании нейтрофилов, экспрессирующих и/ или не экспрессирующих CD64 и CD15: снижение уровней CD64^-CD15⁺ и CD64⁺CD15⁺ клеток, но при увеличении количества CD64^-CD15^- и CD64⁺CD15^- клеток. Также выраженные изменения обнаружены у детей с ИМ старшей возрастной группы в перераспределении нейтрофилов с экспрессией CD32 и CD11b: увеличение относительно контрольных значений количества CD32^-CD11b⁺- и CD32^-CD11b^- клеток, понижение содержания CD32⁺CD11b⁺ и CD32⁺CD11b^- клеток. При исследовании клеток с экспрессией CD11b и CD15 обнаружено, что у детей в возрасте 7-11 лет с ИМ относительно контрольных показателей повышено количество CD11b^-CD15⁺ нейтрофилов, но снижено содержание CD11b⁺CD15⁺ и CD11b⁺CD15^- клеток.

 

Таблица 3. Фенотипический состав нейтрофилов крови (в %) у детей в возрасте 7-11 лет с инфекционным мононуклеозом, Ме (Q_0,25-Q_0,75)

Table 3. Phenotypic composition of blood neutrophils (in %) in children aged 7-11 years with infectious mononucleosis, Ме (Q_0.25-Q_0.75)

Показатели Indicators	Контроль Control	Больные ИМ Patients with IM	р
Лейкоциты, 109/л Leukocytes, 109/L	7,98 (5,42-9,83)	12,65 (10,15-17,00)	< 0,001
Нейтрофилы, % Neutrophils, %	56,0 (48,3-67,6)	27,5 (21,5-41,0)	< 0,001
Нейтрофилы, 109/л Neutrophils, 109/L	4,31 (2,91-6,36)	3,39 (2,60-5,33)
CD64-CD32+	90,65 (82,98-94,95)	38,82 (30,16-45,08)	< 0,001
CD64+CD32+	1,34 (0,52-2,65)	1,21 (0,83-1,59)
CD64-CD32-	5,58 (1,89-8,62)	60,82 (52,18-66,13)	< 0,001
CD64+CD32-	0,08 (0,004-0,820)	1,17 (0,10-2,24)	0,038
CD64-CD11b+	95,37 (91,57-96,81)	93,39 (91,56-95,21)
CD64+CD11b+	1,72 (1,32-2,82)	4,15 (1,83-6,46)	0,027
CD64-CD11b-	1,85 (1,12-4,82)	2,44 (1,93-2,94)
CD64+CD11b-	0,02 (0,008-0,094)	0,015 (0,010-0,020)
CD64-CD15+	95,56 (90,11-95,11)	64,22 (57,06-78,37)	< 0,001
CD64+CD15+	1,80 (0,97-4,40)	0,78 (0,40-1,53)	0,040
CD64-CD15-	4,03 (2,53-5,34)	32,65 (26,96-39,08)	< 0,001
CD64+CD15-	0,14 (0,05-0,17)	0,89 (0,55-1,69)	< 0,001
CD32-CD11b+	1,91 (0,61-3,48)	94,39 (87,64-97,03)	< 0,001
CD32+CD11b+	94,22 (84,59-97,12)	3,05 (2,10-4,00)	< 0,001
CD32-CD11b-	0,54 (0,12-1,29)	2,48 (1,53-3,43)	0,007
CD32+CD11b-	1,18 (0,67-2,63)	0,075 (0,020-0,130)	0,002
CD11b-CD15+	1,42 (0,88-3,55)	54,88 (37,64-68,02)	< 0,001
CD11b+CD15+	94,74 (92,21-96,82)	43,46 (35,09-50,87)	< 0,001
CD11b-CD15-	0,45 (0,18-0,96)	0,50 (0,21-0,97)
CD11b+CD15-	2,05 (1,50-3,80)	1,01 (0,54-1,62)	0,026

 

При исследовании особенностей фенотипа нейтрофилов в зависимости от возраста детей установлено, что у здоровых детей в возрасте 7-11 лет в периферической крови снижено количество CD64⁺CD32^- (р = 0,008), CD64⁺CD11b⁺ (р = 0,047), CD64⁺CD11b^- (р = 0,003) и CD32^-CD11b^-нейтрофилов (р = 0,038) (см. табл. 2 и 3). У детей с ИМ в возрасте 7-11 лет по сравнению с показателями, выявленными у больных детей 1-3 лет, повышено количество CD64^-CD11b^- нейтрофилов (р = 0,048), но понижено содержание CD64⁺CD15^- (р = 0,042), CD11b^-CD15^- (р = 0,016) и CD11b⁺CD15^- клеток (р < 0,001). Кроме того, при ИМ у детей двух возрастных групп выявлено выраженное перераспределение нейтрофилов, экспрессирующих и/или не экспрессирующих CD32 и CD11b. У детей старшей возрастной группы в крови увеличен уровень CD32^-CD11b⁺-нейтрофилов (р < 0,001), но понижено содержание CD32⁺CD11b⁺ (р < 0,001), CD32^-CD11b^- (р < 0,001) и CD32⁺CD11b^- клеток (р < 0,001).

Обсуждение

Нейтрофильные гранулоциты являются одними из наиболее высокореактивных клеток врожденного иммунитета. При этом функциональная и регуляторная активность нейтрофилов характеризуется комплексом экспрессированных на них рецепторов, кооперация которых может модулировать реактивность клеток при иммунопатологических процессах [4, 6]. Мы провели исследование содержания нейтрофилов с парной комбинацией экспрессии маркеров, характеризующих функциональные, регуляторные и адгезионные свойства клеток, у детей с ИМ в возрасте 3-6 и 7-11 лет. Как уже было установлено ранее, реализация широкого спектра функциональной активности, включающая эффекторные и регуляторные, у нейтрофилов определяется экспрессией рецепторов CD64 и CD32 [6]. Рецептор CD64 (FcγRI) определяется как одноцепочечный гликопротеин типа I, относится к суперсемейству иммуноглобулинов, является высокоаффинным рецептором IgG [18]. Доказано, что данный маркер принимает участие в механизмах антителозависимой клеточной цитотоксичности и практически не экспрессируется на нейтрофилах, находящихся в состоянии относительного покоя [6]. Маркер CD32 (FcγRIIa) характеризуется как трансмембранный гликопротеин, является низкоаффинным рецептором IgG, запускает тирозинкиназный каскад, что приводит к активации NADPH-оксидазы, опосредует секреторную активность, цитотоксические процессы и иммуномодулирующие механизмы нейтрофилов [6, 11]. При обследовании детей с ИМ было установлено, что на фоне лейкоцитоза происходит перераспределение соотношения нейтрофильных гранулоцитов, экспрессирующих и не экспрессирующих CD64 и CD32. Независимо от возрастной группы обследуемых преобладающими при ИМ являются дубль-отрицательные нейтрофилы (CD64^-CD32^-), в то время как у здоровых детей – CD64^-CD32⁺ клетки. Фракция CD64^-CD32^- нейтрофилов у здоровых детей является минорной. В связи с тем, что данные клетки не экспрессируют оба функциональных маркера, их можно определить, как клетки с минимальной функциональной активностью. В то же время, количество CD64^-CD32⁺ нейтрофилов у детей с ИМ в возрасте 3-6 и 7-11 лет уменьшается относительно контрольных значений в 2,1 и 2,3 раза, соответственно. Как отмечено в исследовании Нестеровой И.В. с соавт. (2021), фракция нейтрофилов отрицательная по CD64 и положительная по CD32 является «бдительным стражем», которая при антигенном воздействии меняет репертуар своих рецепторов для активизации функционального потенциала [6]. При этом минорными фракциями нейтрофилов у детей с ИМ являются клетки с фенотипами CD64⁺CD32⁺ и CD64⁺CD32^-. Следовательно, на фоне данной вирусной инфекции в крови у детей снижается количество нейтрофилов, положительных по маркерам CD64 и CD32, что свидетельствует о снижении функциональной активности клеток. При сравнении содержания нейтрофилов в крови у детей с парной комбинацией рецепторов CD64 и CD32 обнаружено снижение уровня CD64⁺CD32^- клеток у здоровых детей, тогда как онтогенетических особенностей при ИМ не выявлено.

Следующей комбинацией было исследовано количество нейтрофилов, экспрессирующих и/или не экспрессирующих рецепторы CD64 и CD11b. Маркер CD11b является трансмембранным гликопротеином типа I и определяется как субъединица αM интегрина, объединяется с антигеном CD18 (субъединица интегрина β2) для создания интегрина Mac-1 (CD11b/CD18, αMβ2, CR3, iC3bR, Mo-1) [14]. Установлено, что в лейкоцитах крови Mac-1 экспрессируется в неактивной форме, но под влиянием хемокинов быстро активируется, обеспечивая адгезию к эндотелиальным клеткам [6, 12]. Кроме того, Mac-1 также является рецептором для 3-го компонента системы комплемента (iC3b) и способствует фагоцитозу опсонизированных бактерий [19]. Обнаружено, что преобладающей фракцией нейтрофилов по комбинации рецепторов CD64 и CD11b у детей явились CD64^-CD11b⁺ клетки, причем это проявляется как у здоровых детей двух возрастных групп, так и больных ИМ. Также, независимо от возраста и вирусной инфекции, минорными фракциями являются CD64⁺CD11b⁺, CD64^-CD11b^- и CD64⁺CD11b^- нейтрофилы. Исходя из функциональной значимости рецепторов CD64 и CD11b можно заключить, что наиболее функционально активными клетками являются дубль-положительные нейтрофилы (CD64⁺CD11b⁺), которые определяются как клетки с высоким уровнем функциональной активности (в связи с экспрессией CD64) и способные к быстрой миграции в ткань (CD11b⁺) [6]. При этом количество нейтрофилов с данным фенотипом повышается при ИМ независимо от возраста больных детей: в 2,3 раза у детей в 1-й возрастной группе и в 2,4 раза во второй возрастной группе. Кроме того, у детей с ИМ в возрасте 3-6 лет снижается уровень CD64⁺CD11b^- нейтрофилов. Следовательно, на вирусной инфекции отсутствует значимое перераспределение фракций нейтрофилов у детей с экспрессией и/или отсутствием экспрессии маркеров CD64 и CD11b. Повышение количества функционально активных и способных проявлять высокий уровень миграционной активности нейтрофилов при ИМ определяется развитием защитной реакции организма на вирусную инфекцию. Также обнаружены онтогенетические особенности в распределении CD64^+/-CD11b^+/- нейтрофилов у детей. Так, у здоровых детей с возрастом снижается количество CD64⁺CD11b⁺ и CD64⁺CD11b^- клеток, тогда как при ИМ повышается уровень CD64^-CD11b^- нейтрофилов. Следовательно, у больных детей наблюдается нарушение нормального онтогенетического перераспределения нейтрофилов с парной комбинацией антигенов CD64 и CD11b, что, безусловно, связано с особенностью иммунопатогенеза ИМ.

Антиген CD15 (3-фукозил-N-ацетиллактозамин, Lewis X) представляет собой углеводную молекулу адгезии, которая синтезируется фукозилтрансферазами FUT4 и FUT9, принимает активное участие в процессах миграции клеток [21]. Также в исследовании Nan J. и соавт. (2017) показано, что рецептор CD15 экспрессируется на миелоидных супрессорных клетках (MDSC, myeloid-derived suppressor cells) и является сигнальной молекулой, инициирующей провоспалительные функции [16]. Мажорной фракцией нейтрофилов в крови у детей являются клетки с фенотипом CD64^-CD15⁺, независимо от возрастной группы и наличия инфекционного заболевания. Однако у больных детей количество CD64^-CD15⁺ нейтрофилов значительно снижается (в 1,6 и 1,5 раза у детей в возрасте 3-6 и 7-11 лет соответственно), но увеличивается содержание CD64^-CD15^- клеток (в 16,7 и 8,1 раза для младшей и старшей возрастных групп соответственно), тем самым определяя дубль-отрицательные клетки по CD64 и CD15 как вторые по количеству в крови при ИМ. Соответственно, независимо от возраста в крови у здоровых детей к минорным фракциям нейтрофилов относятся клетки с фенотипами CD64⁺CD15⁺, CD64^-CD15^- и CD64⁺CD15^-, при ИМ – CD64⁺CD15⁺ и CD64⁺CD15^-. При этом у детей с ИМ в крови независимо от возраста повышается уровень CD64⁺CD15^- нейтрофилов, и только у больных в возрасте 7-11 лет относительно контрольных значений снижается количество CD64⁺CD15⁺ клеток. Следовательно, перераспределение количества нейтрофилов при ИМ реализуется в направлении минимальной функциональной активности, включая стимуляцию провоспалительных процессов. Причем у детей старшей возрастной группы снижение провоспалительной активности нейтрофилов более выражено, чем у детей младшего возрастного диапазона. Возрастные особенности в перераспределении рецепторов CD64 и CD15 обнаружены только при ИМ – снижение количества CD64⁺CD15^- нейтрофилов.

При анализе распределения парной комбинации антигенов CD32 и CD11b обнаружено, что если у здоровых детей независимо от возраста основной фракцией нейтрофилов являются клетки с фенотипом CD32⁺CD11b⁺, то у детей с ИМ также независимо от возраста в крови преобладают клетки с фенотипом CD32^-CD11b⁺. При этом количество CD32^-CD11b⁺ нейтрофилов при ИМ повышается у детей в возрасте 3-6 лет в 25 раз и у детей в возрасте 7-11 лет в 49,4 раза. Содержание CD32⁺CD11b⁺ нейтрофилов у больных детей младшей возрастной группы снижается почти в 5 раз, а у больных старшей возрастной группы – в 30,9 раза. Минорными фракциями нейтрофилов по комбинации рецепторов CD32 и CD11b у здоровых детей, независимо от возраста, являются клетки с фенотипами CD32^-CD11b⁺, CD32^-CD11b^- и CD32⁺CD11b^-. В то же время у детей с ИМ в возрасте 3-6 лет к минорной фракции можно отнести только клетки с фенотипом CD32⁺CD11b^-, тогда как минорными фракциями у детей с ИМ в возрасте 7-11 лет являются CD32⁺CD11b⁺, CD32^-CD11b^- и CD32⁺CD11b^- нейтрофилы. В связи с тем, что основное перераспределение нейтрофилов при ИМ произошло в направлении увеличения содержания клеток с фенотипом CD32^-CD11b⁺, можно заключить, что при ИМ повышается уровень клеток способных к миграции, но с низкой функциональной активностью. При этом по данной комбинации антигенов выявляются значительные возрастные изменения, особенно при ИМ. Так, если у здоровых детей старшей возрастной группы по сравнению с показателями, выявленными у детей младшей возрастной группы, уменьшается только количество CD32^-CD11b^- нейтрофилов, то у больных детей выявляется полное перераспределение содержания клеток по данным маркерам: повышение количества CD32^-CD11b⁺ нейтрофилов и снижение уровней CD32⁺CD11b⁺, CD32^-CD11b^- и CD32⁺CD11b^- нейтрофилов. Соответственно, подобное перераспределение количества нейтрофилов с указанными фенотипами преимущественно определяется иммунопатогенезом вирусной инфекции.

Также на фоне данной вирусной инфекции выявляется перераспределение количества нейтрофилов у детей по комбинации антигенов CD11b и CD15. По данным маркерам основной фракцией нейтрофилов у здоровых детей в обеих возрастных группах являются клетки с фенотипом CD11b⁺CD15⁺, минорными – клетки с фенотипами CD11b^-CD15⁺, CD11b^-CD15^- и CD11b⁺CD15^-. По сравнению с контрольными значениями содержание CD11b⁺CD15⁺ нейтрофилов уменьшается у детей с ИМ в возрасте 3-6 лет почти в 2,4 раза, а у больных в возрасте 7-11 лет – почти в 2,2 раза. При этом уровень CD11b^-CD15⁺ нейтрофилов у больных младшего возраста увеличивается в 44,7 раза, тогда как у детей с ИМ старшей возрастной группы – в 38,6 раза. Соответственно, у детей с ИМ основными фракциями нейтрофилов являются клетки с фенотипами CD11b^-CD15⁺ и CD11b⁺CD15⁺, а минорными – CD11b^-CD15^- и CD11b⁺CD15^- клетки. Подобное перераспределение характеризует снижение миграционной активности нейтрофилов, осуществляющих провоспалительные функции. При этом у детей младшего возраста увеличивается содержание дубль-отрицательных по данным антигенам клеток, т. е. нейтрофилов с низким уровнем функциональной и миграционной активности. Подобного у детей старшей возрастной группы не обнаружено, но выявляется понижение количества CD11b⁺CD15^- нейтрофилов – клеток, способных к миграции, но со сниженной провоспалительной активностью. Зависимые от возраста изменения выявляются только при ИМ: у детей старшей возрастной группы снижается количество CD11b^-CD15^- и CD11b⁺CD15^- нейтрофилов.

Заключение

Таким образом, у детей с ИМ на фоне лейкоцитоза значительно меняется фенотип нейтрофилов крови. Соответственно, изменение фенотипа, безусловно, определяет нарушения функциональной и миграционной активности клеток. Так, при исследовании фенотипа нейтрофилов по комбинации двух функциональных антигенов CD64 и CD32 обнаружено, что у детей с ИМ независимо от возраста основной фракцией нейтрофилов крови являются дубль-отрицательные клетки, тогда как у здоровых детей – CD64^-CD32⁺ нейтрофилы. Основная фракция нейтрофилов в парной комбинации антигенов CD64 и CD11b у больных детей 3-6 и 7-11 лет определяется такая же, как и у здоровых (CD64^-CD11b⁺), но при изменении содержания минорных фракций клеток. Количество CD64^-CD15⁺ нейтрофилов (основная фракция клеток у здоровых детей) у больных обеих возрастных группах значительно снижается, но при этом наблюдается выраженное увеличение уровня дубль-отрицательных клеток по антигенам CD64 и CD15, что характеризуется снижением провоспалительных функций нейтрофилов в острую стадию данной вирусной инфекции. По экспрессии рецепторов CD32 и CD11b у детей с ИМ независимо от возраста в качестве основной фракции нейтрофилов выявляются клетки с фенотипом CD32^-CD11b⁺, тогда как у здоровых детей – CD32⁺CD11b⁺. При этом в обеих возрастных группах больных детей также повышается содержания дубль-отрицательных нейтрофилов по данным маркерам. В качестве основных фракций нейтрофилов по парной комбинации антигенов CD11b и CD15 при ИМ выявляются клетки с фенотипами CD11b^-CD15⁺ и CD11b⁺CD15⁺, у здоровых детей – только CD11b⁺CD15⁺ нейтрофилы. Подобное перераспределение характеризует снижение миграционной способности нейтрофилов с высокой активностью провоспалительных функций. При сравнении распределения нейтрофилов по парным комбинациям антигенов у детей разных возрастных групп обнаружены онтогенетические особенности (у здоровых детей), которые значительно изменяются у детей с ИМ, что, по-видимому, определяется иммунопатогенезом вирусной инфекции. Выявленные изменения в фенотипическом составе нейтрофилов при ИМ могут определяться как особенностью защитной реакции клеток врожденного иммунитета, так и патогенным действием самого вируса на нейтрофилы и должны быть учтены при разработке новой иммунотерапевтической стратегии лечения ИМ.

About the authors

Andrei A. Savchenko

Research Institute of Medical Problems of the North, Krasnoyarsk Research Center, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: aasavchenko@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Laboratory of Cellular Molecular Physiology and Pathology

Russian Federation, Krasnoyarsk

G. P. Martynova

V. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: doc-martynova@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Childhood Infectious Diseases

Russian Federation, Krasnoyarsk

L. A. Ikkes

V. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: likkes@bk.ru

Assistant Professor, Department of Сhildhood Infectious Diseases with a PE-course

Russian Federation, Krasnoyarsk

V. D. Belenyuk

Research Institute of Medical Problems of the North, Krasnoyarsk Research Center, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: dyh.88@mail.ru

Junior Research Associate, Laboratory of Cellular Molecular Physiology and Pathology

Russian Federation, Krasnoyarsk

A. G. Borisov

Research Institute of Medical Problems of the North, Krasnoyarsk Research Center, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: 2410454@mail.ru

PhD (Medicine), Leading Research Associate, Laboratory of Cellular Molecular Physiology and Pathology

Russian Federation, Krasnoyarsk

References

Supplementary files