Influence of endomorphins-1, 2 on glucose uptake by T and B lymphocytes in vivo

Full Text

Введение

Важной проблемой и предметом интенсивных исследований в современной медицине остается терапия боли [5, 10]. В настоящий момент основным способом лечения боли является введение пациентам морфина и его аналогов. Тем не менее продолжительное применение морфина может привести к развитию как физической, так и психологической зависимости, являющейся серьезным препятствием на пути обеспечения обезболивания [9, 12, 14]. Помимо этого, побочным эффектом применения морфина является подавление иммунного ответа и, следовательно, повышение уязвимости к инфекциям [11, 12]. В связи с этим многие современные исследования направлены на поиск более безопасных анальгезирующих соединений.

Среди аналогов морфина большое внимание уделяется соединениям эндогенного происхождения – эндогенным опиоидным пептидам. Эти вещества проявляют анальгетическую активность, связываясь с опиоидными рецепторами, широко распространенными в центральной нервной системе. Эндоморфины относятся к семейству эндогенных опиоидных пептидов и представляют собой тетрапептиды, являющиеся высокоаффинными селективными агонистами μ-рецептора. Благодаря своей структуре эндоморфины представляют собой потенциальный заменитель низкомолекулярных опиатов [8]. Данные соединения действуют подобно морфину, но, предположительно, подавляют боль без некоторых нежелательных побочных эффектов (таких как толерантность и зависимость), вызываемых растительными опиатами [7]. Благодаря этому, в литературе эндоморфины рассматривают как перспективные соединения для терапии боли [6, 8, 15].

Хотя применение эндоморфинов позволяет избежать многих нежелательных эффектов, связанных с приемом опиатов, последние исследования указывают на то, что данные соединения могут оказывать иммуномодулирующий эффект на организм [13]. Так, показано, что эндоморфины-1, 2 угнетают продукцию кислородных радикалов в лейкоцитах периферической крови и перитонеальных макрофагах, а также увеличивают поглотительную активность нейтрофилов, моноцитов и лейкоцитов периферической крови in vitro [2]. Кроме того, данные пептиды стимулируют продукцию IL-1β в спонтанных культурах мононуклеаров периферической крови и снижают выработку IL-10 в стимулированных клетках [3]. Наконец, эндоморфины-1, 2 существенно усиливают антителогенез селезенки и повышают продукцию IL-17 in vivo, а также усиливают апоптоз CD8⁺ Т-лимфоцитов in vitro [4]. Несмотря на то, что в литературе представлено мало информации об исследовании иммунорегуляторных эффектов эндоморфинов, статей, посвященных изучению влияния данных пептидов на Т- и В-лимфоциты, практически нет.

В настоящий момент общепризнано, что функциональная активность иммунных клеток обеспечивается метаболизмом. Данный процесс снабжает клетки энергией, необходимой для активации, дифференцировки, пролиферации, апоптоза и др. Ключевую роль в обеспечении функций иммунных клеток играет метаболизм глюкозы [1]. Поскольку изменения метаболического статуса клеток тесно связано с иммунными процессами, в настоящей статье будет рассмотрено как иммуномодулирующее воздействие эндоморфинов способно влиять на изменение поглощения глюкозы лимфоцитами.

Цель настоящей работы – оценить влияние эндоморфинов-1, 2 на особенности поглощения глюкозы Т- и В-лимфоцитами in vivo.

Материалы и методы

Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и рекомендациям локального биоэтического комитета Института экологии и генетики микроорганизмов – филиала ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр УрО РАН» (Пермь), IRB00010009.

Для изучения влияния эндоморфинов на метаболизм лимфоцитов животные были разделены на 3 группы: 1) контрольные мыши, которым был введен 0,9% раствор NaCl; 2) и 3) мыши, которым были введены эндоморфин-1 и эндоморфин-2 (Sigma, США), соответственно. Пептиды вводились мышам внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/ кг. Через час после введения пептида, животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом. Выделенные селезенки гомогенизировали в 4 мл раствора Хенкса (ООО «БиолоТ», Россия), после чего спленоциты центрифугировали 10 мин при 300 g. К полученному осадку добавляли 1 мл полной питательной среды, которую готовили на основе среды RPMI 1640 (Gibco, Великобритания) с добавлением 10 мМ HEPES (Sigma, США), 2мМ Glutamax (Sigma-Aldrich, США), 100 eд/мл гентамицина (BioChemica, Германия), 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Capricorn Scientific, Германия) и 10 μМ 2-меркаптоэтанола (Gibco, США)).

Спленоциты культивировали в 24-луночных плоскодонных планшетах (Orange Scientific, Бельгия) в течение 96 часов при 37 °С в концентрации 2 × 10⁶ клеток в 1 мл полной питательной среды. В качестве индуктора Т-лимфоцитов использовали конканавалин А (Concanavalin A (ConA), MP Biomedicals, Франция) в концентрации 10 мкг/ мл. В-лимфоциты стимулировали липополисахаридом (Lipopolysaccharide (LPS), Serva, Франция) в концентрации 10 мкг/мл. По окончанию инкубации производили сбор культур в эппендорфы. Образцы центрифугировали (1000 g, 3 мин) при комнатной температуре и ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе Дульбекко (Dulbecco›s phosphate buffered saline – DPBS; Gibco, США) содержащем 0,5M этилендиаминтетрауксусной кислоты.

Анализ проводили на проточном цитофлюориметре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США). Жизнеспособные клетки определяли по отсутствию окрашивания 7-AAD (Beckman Coulter, США). При определении фенотипа клеток использовали анти-CD3-APC/Cy7, анти-CD19-APC и анти-CD4-PE антитела (BioLegend, США). Определяли Т-лимфоциты (CD3⁺), CD4⁺ Т-клетки (CD3⁺CD4⁺), CD4^-Т-клетки (CD3⁺CD4^-) и В-лимфоциты (CD19⁺).

Поглощение глюкозы клетками оценивали с использованием флуоресцентных аналогов глюкозы (2-NBDG). Клетки, окрашенные поверхностными антителами, инкубировали в среде, содержащей 80 мкМ 2-NBDG (Abcam, Великобритания) при 37 °С в течение 15 мин. Затем двукратно вносили DPBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (Bovine Serum Albumin – BSA; Sigma-Aldrich, США), и осаждали клетки центрифугированием (1000 g, 3 мин). Образцы ресуспендировали в 100 мкл DPBS и инкубировали в течение 5 мин при температуре +4 °С перед цитометрическим анализом.

Статистический анализ данных осуществляли в программе FlowJo v. 10.0 (FlowJo LLC, США) с использование t-критерия Уэлча.

Результаты и обсуждение

Анализ влияния эндоморфинов на потребление глюкозы в популяциях Т- и В-лимфоцитов мыши (рис. 1А, Б) показал следующее. Эндоморфин-1 не влиял на интенсивность потребления глюкозы как в Т-, так и в В-клетках. Введение животным эндоморфина-2, напротив, приводило к существенному усилению поглощения глюкозы в Т-лимфоцитах. При этом уровень потребления глюкозы в В-клетках после введения эндоморфина-2 значительно не изменялся.

 

Рисунок 1. Влияние эндоморфинов-1, 2 на потребление глюкозы в популяциях T-лимфоцитов (А) и В-лимфоцитов (Б) мыши

Примечание. Горизонтальные линии внутри прямоугольников (медианы), интерквартильные размахи (прямоугольники) и 10-90% перцентили (вертикальные отрезки). * – p < 0,05. MFI (Mean Fluorescence Intensity) – средняя интенсивность флуоресценции. К – контроль, Э1 – эндоморфин-1, Э2 – эндоморфин-2.

Figure 1. Effect of endomorphins-1, 2 on glucose uptake in populations of mouse T lymphocytes (A) and B lymphocytes (B)

Note. Horizontal lines inside rectangles (medians), interquartile ranges (rectangles) and 10-90% percentiles (vertical segments). *, p < 0.05. MFI (Mean Fluorescence Intensity), average fluorescence intensity. K, control, E1, endomorphin-1, E2, endomorphin-2.

 

При исследовании двух субпопуляций Т-лимфоцитов было отмечено, что эндоморфин-2 приводит к увеличению потребления глюкозы как в CD4⁺, так и в CD4^-Т-клетках (рис. 2А, Б). Введение эндоморфина-1 не оказало существенного влияния на уровень поглощения этого субстрата в обеих субпопуляциях Т-лимфоцитов.

 

Рисунок 2. Влияние эндоморфинов-1, 2 на потребление глюкозы CD4+ (А) и CD4-Т-лимфоцитами (Б) мыши

Примечание. См. примечание к рисунку 1.

Figure 2. Effect of endomorphins-1, 2 on glucose uptake by mouse CD4⁺ (A) and CD4^-T lymphocytes (B)

Note. As for Figure 1.

 

Пролиферирующие В-лимфоциты, в отличие от покоящихся клеток, после введения эндоморфина-2 усиливали потребление глюкозы в присутствии LPS. Т-клетки, стимулированные ConA, напротив, не отличались по потреблению глюкозы у контрольных мышей и мышей с инъекцией эндоморфинов (рис. 3А).

 

Рисунок 3. Влияние эндоморфинов-1, 2 на потребление глюкозы в Т-лимфоцитах, стимулированных конканавалином А (А), и В-лимфоцитах, стимулированных LPS (Б)

Примечание. См. примечание к рисунку 1.

Figure 3. Effect of endomorphins-1, 2 on glucose uptake in T lymphocytes stimulated with Con A (A) and B lymphocytes stimulated with LPS (B)

Note. As for Figure 1.

 

При оценке влияния эндоморфинов на стимулированные ConA культуры Т-лимфоцитов было установлено, что оба эндоморфина не оказали существенного влияния на потребление глюкозы в пролиферирующих CD4⁺ и CD4^-Т-клетках (рис. 4А, Б).

 

Рисунок 4. Влияние эндоморфинов-1, 2 на потребление глюкозы CD4⁺ (А) и СD4^-Т-лимфоцитами (Б), стимулированными конканавалином А

Примечание. См. примечание к рисунку 1.

Figure 4. Effect of endomorphins-1, 2 on glucose uptake by Con A stimulated mouse CD4⁺ (A) and CD4^-T lymphocytes (B)

Note. As for Figure 1.

 

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что эффект двух пептидов на метаболизм клеток адаптивного иммунитета проявлялся неодинаково. Эндоморфин-1 на потребление глюкозы существенного влияния не оказал, в то время как введение эндоморфина-2 существенно усиливало метаболизм глюкозы в покоящихся Т-лимфоцитах, а также LPS индуцированных В-лимфоцитах. Усиление метаболизма глюкозы в Т- и В-клетках нередко связывают с процессом активации и с усилением воспаления. Так, повышенное потребление глюкозы необходимо для синтеза провоспалительных цитокинов, продукции антител и т. д. Таким образом, можно предположить, что эндоморфин-2, усиливая метаболизм глюкозы, может способствовать приобретению клетками более провоспалительного фенотипа. Эти данные согласуются с ранее полученными результатами. Так, нами было показано, что эндоморфины-1, 2 стимулируют синтез провоспалительных цитокинов IL-1β в спонтанных культурах мононуклеаров периферической крови и IL-17 спленоцитами. При этом продукция IL-10 в стимулированных культурах мононуклеаров периферической крови под действием эндоморфинов снижалась. Также эндоморфины существенно усиливали антителогенез селезенки [3]. При этом эффект эндоморфина-2 во всех проведенных экспериментах проявлял свои эффекты более выражено, по сравнению с эндоморфином-1.

Возможно, эндоморфин-2 в большей мере оказывает провоспалительное действие на адаптивный иммунитет по той причине, что данный пептид способен стимулировать Т- и В-клеточный метаболизм.

Заключение

Таким образом, из вышесказанного следует, что если рассматривать эндоморфины как перспективные соединения, применяемые в терапии боли, необходимо учитывать их иммуномодулирующее воздействие на организм. Настоящее исследование показало, что эндоморфин-1, в отличие от эндоморфина-2, не оказывает существенного влияния на метаболизм глюкозы в Т- и В-клетках. Принимая во внимание роль гликолиза в функционировании иммунных клеток и реализации воспаления, можно заключить, что применение эндоморфина-1 может быть сопряжено с меньшим риском возникновения побочных эффектов, связанных с иммунной системой.

About the authors

S. V. Gein

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; Perm State National Research University

Author for correspondence.
Email: gein@iegm.ru

PhD, MD (Medicine), Director; Professor, Department of Microbiology and Immunology

Russian Federation, Perm; Perm

Ya. A. Kadochnikova

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: gein@iegm.ru

Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files