The influence of modulation of intestinal microbiota on clinical and immunological parameters and oxytocin levels in children with autism spectrum disorders

Full Text

Введение

Расстройства аутистического спектра (РАС) представляют собой группу неврологических состояний, характеризующихся дефицитом в социальном взаимодействии, ограниченными интересами и повторяющимся поведением. Одним из распространенных симптомов у детей с РАС являются желудочно-кишечные расстройства, такие как запоры, диарея, боли в животе [14], сопровождающиеся изменением параметров иммунного воспаления. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что состав кишечной микробиоты значительно отличается у детей с РАС по сравнению со здоровыми детьми, микробиота кишечника может играть важную роль в развитии РАС, предполагая взаимосвязь между кишечной микробиотой и центральной нервной системой через ось «мозг-кишечник» [1, 8]. Иммунологическая дисрегуляция, вызванная изменениями в кишечной микробиоте, может привести к усилению воспалительных процессов, что в свою очередь может оказывать воздействие и на социальное поведение.

Микробиота кишечника воздействует на нервную систему через различные механизмы, включая нервные, иммунные, нейроэндокринные и метаболические пути [2, 6]. Ключевыми путями связи между кишечной микробиотой и мозгом являются блуждающий нерв, метаболиты триптофана и короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), пептидогликаны. Микробиота кишечника может влиять на мозг посредством модуляции серотонинергической, норадренергической, дофаминергической, глутаматергической и ГАМК-ергической нейротрансмиссии. К примеру, Candida, Escherichia, Enterococcus и Streptococcus участвуют в производстве серотонина, Bifidobacterium синтезируют ГАМК, а Lactobacillus дополнительно производит ацетилхолин [3]. В частности, отмечен дисбаланс Bacteroidetes/Firmicutes увеличение Bacteroidetes, Sutterella, Prevotella выявлено у детей с РАС [14]. Также при РАС наблюдается увеличение Clostridium spp. [13], Lachnospiraceae и Ruminococcaceae, а Bacteroidetes, а уровни Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. снижены [1, 15].

Одним из важных представителей микробиоты является семейство Lactobacillus reuteri – гетероферментативные молочнокислые бактерии, которые путем ферментации образуют короткоцепочечные жирные кислоты (уксусную и молочную), синтезируют уникальную молекулу реутерин. Реутерин оказывает прямое противомикробное действие и способен корректировать состав микробиоты путем ингибирования роста Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus и H. pylori, а также оказывает влияние на синтез провоспалительных цитокинов, перепрограммируя активацию регуляторных Т-клеток [4, 7]. В исследованиях на животных обнаружено, что некоторые штаммы Lactobacillus reuteri участвуют в синтезе окситоцина или опосредуют его синтез. Предполагается, что дефицит социальных взаимодействий при аутизме может быть опосредован гипоактивностью нейропептида окситоцина или его недостаточной продукцией. Окситоцин, кроме центрального синтеза в гипоталамусе, также синтезируется в периферических зонах, а именно в клетках сердца (желудочках, предсердиях, в стенке дуги аорты), в мышечных клетках по всей длине пищеварительного тракта, в матке, яичниках, плаценте, амнионе, желтом теле, семенниках, придатках яичка, предстательной железе. Рецепторы к окситоцину OXTR-V3, как оказалось, эксрпессируются на всех субпопуляциях Т-лифмоцитов и макрофагах, эпителиальных и эндотелиальных, стволовых клетках, в тимусе, поджелудочной железе, адпиоцитах. Периферическая поддержка синтеза окситоцина индуцируется бактериями: Лактобациллы reuteri и Lactobacillus plantarum PS128 [10, 11, 12]. В 2021 году в крупном рандомизированном плацебо-контролируемом исследовании было продемонстрировано, что одновременный прием интраназального окситоцина и пробиотиков Lactobacillus plantarum могут уменьшить основные социально-поведенческие симптомы у людей с РАС [9]. Есть основания предполагать, что создание пробиотиков, содержащих Lactobacillus reuteri могут восстанавливать социальный дефицит у людей с РАС путем индукции эндогенного окситоцина. Между тем, обоснованность применения окситоцина, его влияние на показатели молекулярного воспаления при РАС, эффективность приема пробиотиков остаются дискуссионными.

В данном контексте целью нашего исследования являлась оценка потенциального влияния специализированных штаммов бактерий Lactobacillus reuteri на изменение состава кишечной микробиоты, уровень окситоцина, иммунные показатели и качество жизни детей с РАС.

Материалы и методы

В исследовании участвовала группа детей с диагнозом РАС (n = 43), средний возраст участников составил 9±3 лет. Все участники исследования наблюдались в поликлинике ООО «Центр семейной медицины», город Томск.

Исследование соответствует принципам этики. Все родители детей подписали информированное согласие. Данное исследование является продолжением ранее начавшегося исследования и одобрено этическим комитетом ООО «Центра семейной медицины» (протокол № 7 от 18.03.2019).

Ни один из пациентов не принимал антибиотики или противогрибковые препараты в течение, по меньшей мере, одного месяца до сбора фекальных образцов.

Для оценки тяжести психоневрологических симптомов РАС использовался тест Autism Treatment Evaluation Scale (АТЕС, «Шкала оценки лечения аутизма»).

В рамках исследования дети принимали пробиотический продукт под названием «Панбиолакт Ментал». Основой этого продукта были живые клетки бактерий Lactobacillus reuteri, включая консорциум специализированных штаммов данного вида (ARTB-195, ARTB-147 и ARTB-213), общее количество живых микроорганизмов данного вида составляло не менее 1 × 10⁸ КОЕ/г. Продукт был представлен НПО ООО «АртЛайф» (Томск, Россия). Участники принимали продукт по одной капсуле два раза в день в течение 90 дней. После окончания курса лечения была проведена повторная оценка клинических и лабораторных показателей.

Материалом исследования служили образцы венозной крови и фекальные образцы. В сыворотке крови определяли концентрации цитокинов (IL-4, IL-10, TNFα, IFNγ), иммуноглобулинов (IgE, IgG, IgA, IgМ) и нейропептида окситоцина. Фекальные образцы использовались для оценки качественного и количественного состава микробиоты толстого кишечника.

Для количественного определения состава микробиоты использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью амплификатора DTprime 5 с использованием наборов реагентов «ДНК-технология», Россия) с использованием набора реагентов «КОЛОНОФЛОР-33» («Альфалаб», Россия). Концентрация иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли иммунотурбидиметрическим методом с применением соответствующих наборов наборов «Иммуноглобулин G», «Иммуноглобулин A» и «Иммуноглобулин M» (АО «Вектор-Бест», Россия). Определение концентрации окситоцина проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора Cloud-Clone Corp. (CША). Концентрация цитокинов в сыворотке крови также определялась методом ИФА с использованием соответствующих наборов реагентов.

Статистическая обработка данных была проведена в программе Microsoft Office Excel 2007 и Statistics 10.0 для Windows. Проверка на нормальность распределения выполнена с помощью критерия Шапиро–Уилка. Данные, соответствующие нормальному распределению, представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (M±SD), а данные с ненормальным распределением – в виде медианы и межквартильного интервала (Ме (Q_0,25-Q_0,75). Дальнейший анализ различий между выборками проводили при помощи t-критерия Стьюдента для зависимых выборок или Т-критерия Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

В результате проведенного исследования были выявлены значимые изменения у детей с РАС после приема продукта «Панбиолакт Ментал». В частности, мы наблюдали значительные изменения в составе микробиоты кишечника. Эти изменения включали снижение количества бактерий родов Lactobacillus, Acinetobacter и Ruminococcus, а также увеличение количества Bacteroides spp., Akkermansia muciniphila, Eubacterium rectale, Prevotella spp. и Methanobrevibacter smithii, что свидетельствует о сдвиге в сторону более разнообразного и потенциально благоприятного состава микробиоты (табл. 1). Разнообразие микробиоты кишечника определяет генетическую вариацию среди индивидуумов, повышая толерантность к негативным факторам окружающей среды и может служить маркером улучшение состояние детей с РАС.

 

ТАБЛИЦА 1. СОСТАВ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА У ДЕТЕЙ С РАССТРОЙСТВАМИ АУТИСТИЧЕСКОГО СПЕКТРА ДО И ПОСЛЕ ПРИЕМА «ПАНБИОЛАКТ МЕНТАЛ»

TABLE 1. COMPOSITION OF THE INTESTINAL MICROBIOTA IN CHILDREN WITH AUTISM SPECTRUM DISORDERS BEFORE AND AFTER TAKING “PANBIOLACT MENTAL”

Показатель Index	До приема «Панбиолакт Ментал» Before use “Panbiolact Mental”	После приема «Панбиолакт Ментал» After consumption “Panbiolact Mental”	Т
	Ме (Q0,25-Q0,75)	Ме (Q0,25-Q0,75)
Общ. бактериальная масса Total bacterial mass	2 × 1012 (7 × 1011-4 × 1012)	9 × 1011 (4,5 × 1011-2 × 1012)	310,0
Lactobacillus spp.	4 × 105 (1 × 105-3 × 106)	2,5 × 105 (1 × 105-1,5 × 106)	87,5*
Bifidobacterium spp.	2 × 109 (6 × 108-1 × 1010)	7 × 109 (1 × 109-2,5 × 1010)	150,5
Escherichia coli	3 × 106 (2 × 105-2 × 107)	3 × 106 (3,5 × 105-1 × 107)	221,5
Bacteroides spp.	2 × 1012 (6 × 1011-4 × 1012)	4 × 1011 (9 × 1010-2 × 1012)	130,0*
Faecalibacterium prausnitzii	2 × 1010 (6 × 109-5 × 1010)	5 × 1010 (1,5 × 1010-1 × 1011)	134,0
Соотношение Bacteroides spp./ Faecalibacterium prausnitzii Ratio Bacteroides spp./Faecalibacterium prausnitzii	75 (30-200)	10 (1,8-55)	122,5*
Bacteroides thetaiotaomicron	3 × 108 (0-2 × 109)	9,5 × 107 (0-1,5 × 109)	117,5
Akkermansia muciniphila	0 (0-1 × 108)	5 × 106 (0-2 × 109)	49,0*
Enterobacter spp.	0 (0-1 × 106)	0 (0-4,5 × 105)	112,0
Blautia spp.	0 (0-0)	0 (0-2 × 106)	12,0
Acinetobacter spp.	5 × 106 (2 × 106-7 × 106)	1 × 107 (6 × 106-2 × 107)	58,5*
Eubacterium rectale	0 (0-4 × 108)	2 × 109 (8 × 107-8 × 109)	55,5*
Roseburia inulinivorans	2 × 108 (8 × 106-4 × 109)	2 × 109 (4,5 × 108-6 × 109)	155,5
Prevotella spp.	0 (0-0)	4 × 104 (0-2 × 109)	0*
Methanobrevibacter smithii	0 (0-0)	0 (0-2 × 105)	8,0*
Ruminococcus spp.	5 × 104 (0-3*107)	3,8 × 107 (0-6,5*108)	47,5*

Примечание. * – уровень значимости p < 0,05.

Note. *, significance level p < 0.05.

 

Bacteroides spp. и Prevotella spp. известны своей ролью в переработке сложных углеводов и производстве КЦЖК (ацетат, пропионат и бутират), которые играют важную роль в поддержании кишечного барьера и иммунной системы [5]. Akkermansia muciniphila участвует в поддержании слизистого слоя кишечника, используя муцин в качестве источника питания, что способствует обновлению слизистого слоя и поддержанию его целостности [5]. Сниженное количество этих бактерий у детей с РАС может быть связано с нарушением барьерной функции кишечника. Увеличение количества Eubacterium rectale и Methanobrevibacter smithii после приема «Панбиолакт Ментал» также может свидетельствовать о положительном влиянии БАВ на микробиоту кишечника и увеличении эффективности пищеварения.

Кроме того, в нашем исследовании выявлено повышение концентрации окситоцина, сопровождаемое снижением концентраций IL-10 и TNFα, однако при повышение в 2 раза значений соотношения IL-10/TNFα (табл. 2).

 

ТАБЛИЦА 2. ПОКАЗАТЕЛИ У ДЕТЕЙ С РАССТРОЙСТВАМИ АУТИСТИЧЕСКОГО СПЕКТРА ДО И ПОСЛЕ ПРИЕМА «ПАНБИОЛАКТ МЕНТАЛ»

TABLE 2. INDICATORS IN CHILDREN WITH AUTISM SPECTRUM DISORDERS BEFORE AND AFTER TAKING “PANBIOLACT MENTAL”

Показатель Index	До приема «Панбиолакт Ментал» Before use “Panbiolact Mental”	После приема «Панбиолакт Ментал» After consumption “Panbiolact Mental”	Наблюдаемое значение критерия Вилкоксона Wilcoxon Signed Ranks Test
	Ме (Q0,25-Q0,75)	Ме (Q0,25-Q0,75)
IgE (кМЕ/мл) IgE U/mL	89 (19-323)	50 (12-196)	Т = 85,0
Окситоцин (пг/мл) Oxytocin (pg/mL)	531 (337-853)	1139 (92-1193)	Т = 0*
IL-4 (пг/мл) IL-4 (pg/mL)	2,6 (1,8-3,4)	2,2 (1,7-2,8)	Т = 352
IL-10 (пг/мл) IL-10 (pg/mL)	10 (8-14)	9 (6-11)	Т = 96,5*
TNFα (пг/мл) TNFα (pg/mL)	2 (0,9-2,5)	1 (0,6-1,6)	Т = 73,0*
IFNγ (пг/мл) IFNγ (pg/mL)	1,8 (1,0-3,8)	1,5 (1,2-2,5)	Т = 248,0

Примечание. * – уровень значимости p < 0,05.

Note. *, significance level p < 0.05.

 

Окситоцин, нейропептид, известный своей ролью в формировании социальных связей и регуляции эмоциональных состояний, рассматривается как важный фактор в поддержании и улучшении социальной адаптации, а также снижении тревожности и агрессивного поведения у детей с РАС. Недавние исследования указывают на существование взаимодействия между кишечной микробиотой и окситоцином, предполагая, что микробиота может влиять на уровни окситоцина и наоборот [4, 7].

IL-10 подавляет воспаление и способствует развитию Т-регуляторных клеток, которые играют важную роль в поддержании толерантности к собственным антигенам и предотвращении аутоиммунных реакций. Дисбаланс микробиоты может нарушать нормальное производство IL-10, приводя к усилению воспалительного ответа [12].

Снижение уровня TNFα после приема добавки может свидетельствовать о снижении воспалительной активности в организме детей с РАС. Это может быть связано с регуляторным воздействием составляющих продукта «Панбиолакт Ментал» на микробиоту кишечника и последующим модулированием иммунного ответа. Подавление продукции TNFα может способствовать уменьшению воспаления, что в свою очередь потенциально оказывает положительное влияние на клинические проявления РАС, включая снижение неврологических и поведенческих симптомов. При этом важно учитывать соотношение показателей IL10/TNFα как противо- и провоспалительного баланса цитокинов или как коэффициент протолерогенности.

По окончанию 90-дневного курса приема продукта «Панбиолакт Ментал» было зарегистрировано существенное снижение среднего балла АТЕС до 44 (±20) (табл. 3) в отличие от 64 (±14) до приема пробиотческого продукта (t = 5, р < 0,001), что дает основание полагать, что применение данного продукта способствует уменьшению клинических проявлений РАС и повышению качества жизни как самих пациентов, так и социального благополучия членов семьи.

 

ТАБЛИЦА 3. КОЛИЧЕСТВО БАЛЛОВ ПО ИТОГАМ ТЕСТИРОВАНИЯ АТЕС ПАЦИЕНТОВ ДО И ПОСЛЕ ПРИЕМА ПРОБИОТИКА, СОДЕРЖАЩЕГО ЖИВЫЕ КЛЕТКИ БАКТЕРИЙ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ШТАММОВ LACTOBACILLUS REUTERI

TABLE 3. NUMBER OF POINTS BASED ON THE RESULTS OF ATEC TESTING OF PATIENTS BEFORE AND AFTER TAKING A PROBIOTIC CONTAINING LIVE BACTERIAL CELLS OF SPECIALIZED STRAINS OF LACTOBACILLUS REUTERI

Показатель Index	До приема пробиотика Before use “Panbiolact Mental”	После приема пробиотика After consumption “Panbiolact Mental”	Наблюдаемое значение t-критерия Стьюдента Student’s t-test
	M; σ	М; σ
Тестирование АТЕС (баллы) ATEC testing (scores)	64; 14	44; 20	5*

Примечание. * – р < 0,001.

Note. *, significance level p < 0.001.

 

Заключение

Итоги нашего исследования свидетельствуют о значительном положительном влиянии бактерий Lactobacillus reuteri (консорциума специализированных штаммов ARTB-195, ARTB-147 и ARTB-213) в составе продукта «Пабиолакт Ментал» на состояние детей с РАС за 90-дневный период приема. Помимо улучшения показателей АТЕС, что указывает на снижение симптомов РАС, мы наблюдали существенные изменения в составе кишечной микробиоты. Значительное снижение уровня TNFα, умеренное снижение IL-10, что может отражать уменьшение хронического воспаления и регуляторные изменения в иммунной системе, которые связаны с патогенезом РАС. Увеличение уровня окситоцина мы связали с влиянием на социальное поведение и эмоциональное состояние детей, их социальной адаптации и улучшению поведенческих реакций, которые также отметили члены семей. Эти результаты открывают новые перспективы для использования пробиотических добавок в комплексном подходе к управлению и лечению РАС, а также стимулируют дальнейшие исследования в этой области, направленные на изучение долгосрочных эффектов и механизмов действия микробиоты на иммунную систему и неврологическое развитие.

About the authors

N. A. Cherevko

Siberian State Medical University; Medical Association “Center for Family Medicine”

Email: Pavel.N1234@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Immunology and Allergy Department, Siberian State Medical University; Allergist-Immunologist, Co-director, Medical Association “Center for Family Medicine”

Russian Federation, Tomsk; Tomsk

P. S. Novikov

Siberian State Medical University; Medical Association “Center for Family Medicine”

Author for correspondence.
Email: Pavel.N1234@yandex.ru

PhD Applicant, Department of Immunology, Siberian State Medical University; Head, Clinical Diagnostic Laboratory, Medical Association “Center for Family Medicine”

Russian Federation, Tomsk; Tomsk

M. I. Khudyakova

Siberian State Medical University

Email: Pavel.N1234@yandex.ru

Applicant, Department of Immunology

Russian Federation, Tomsk

A. M. Arkhipov

Medical Association “Center for Family Medicine”

Email: Pavel.N1234@yandex.ru

Clinical Laboratory Diagnostics Doctor

Russian Federation, Tomsk

E. A. Loginova

Siberian State Medical University

Email: Pavel.N1234@yandex.ru

5^th year Student of the Faculty of Medicine

Russian Federation, Tomsk

A. A. Vekovtsev

Scientific and Production Association “ArtLife”

Email: Pavel.N1234@yandex.ru

PhD (Medicine), Director for Science and Production

Russian Federation, Tomsk

P. G. Bylin

Scientific and Production Association “ArtLife”

Email: Pavel.N1234@yandex.ru

Leading Engineer for the Implementation of New Equipment and Technologies

Russian Federation, Tomsk

References

Supplementary files