Comparison of methods for evaluation of cellular immunity to mumps virus

Full Text

Введение

Эпидемический паротит – антропонозное вирусное инфекционное заболевание, проявляющееся лихорадкой, слабостью, потерей аппетита и отеком слюнных желез, чаще околоушных. Тропность вируса к железистой ткани может проявляться в виде поражения поджелудочной железы, а также мужских и женских половых желез, что чревато бесплодием [1]. Активная иммунизация против вируса эпидемического паротита, особенно введение двудозовой схемы (в 1 год и 6 лет), значительно снизила, но не устранила заболеваемость этой инфекцией. Периодически происходят подъемы заболеваемости даже среди населения с высоким уровнем охвата прививками [8]. Например, в США около трети случаев было зарегистрировано у детей и подростков, из них 81-94% получили не менее одной дозы вакцины против паротита [13]. Исследования, проведенные во французской армии, показали, что среди военнослужащих за 5 лет до исследования привитых 2 дозами вакцины MMR-II (корь, краснуха, паротит) только у 76% были обнаружены антитела к паротиту при 96% серопозитивных кори и 98% – к краснухе [6]. На территории Российской Федерации на фоне вакцинации заболеваемость эпидемическим паротитом существенно снизилась. С 2009 по 2015 заболеваемость составила менее 1 на 100 тыс. населения. В 2016-2017 гг. наблюдался подъем заболеваемости почти в 6 раз, а затем снова снижение и на фоне противоэпидемических мероприятий, связанных с COVID-19, достигал минимального уровня [5]. Уровень иммунитета к вирусу эпидемического паротита в большинстве исследований оценивают по содержанию специфических антител в сыворотке крови, однако известно, что для противовирусной защиты важнее Т-клеточный иммунитет. Полагают, что он осуществляет защиту организма от вируса даже в отсутствии антител [4]. При вакцинации трехвалентной вакциной Приорикс через 5 лет после вакцинации у всех привитых детей сохранились IgG-антитела к кори и краснухе, но у 10% детей отсутствовали IgG к эпидемическому паротиту, хотя после вакцинации антитела сформировались у всех привитых, а уровень IgG-антител у серопозитивных снизился на 17% [3]. Известно, что Т-клеточный иммунитет к вирусу паротита сохраняется дольше, чем В-клеточный [12]. Однако до сих пор нет общепринятого способа оценки клеточного иммунитета. Используют проточную цитометрию, мультиплексное определение цитокинов и ELISpot, подсчитывая количество клеток, синтезирующих IFNγ после стимуляции антигеном, однако помимо цитотоксических CD8⁺ лимфоцитов этот цитокин синтезируют Th1, NK-, NKT- и γδТ-клетки, и далеко не все из них являются цитотоксическими, что затрудняет истинную оценку клеточного иммунитета [14].

Целью работы было сопоставление двух методов оценки клеточного иммунитета к антигенами вируса эпидемического паротита у интактных и переболевших этой инфекцией взрослых.

Материалы и методы

В простом открытом сравнительном исследовании были обследованы 37 взрослых в возрасте 20-70 лет. Согласно данным анамнеза 20 человек перенесли заболевание эпидемическим паротитом и составили группу 1, тогда как 17 человек не болели эпидемическим паротитом и не прививались от него и составили группу сравнения 2. Биологический материал получали из локтевой вены натощак в вакуумные пробирки с гепарином (4 мл) и с активатором свертывания и гелем (4 мл) для получения сыворотки. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (протокол № 69 от 12.03.2024), обследованные подписывали информированное согласие.

Для получения сыворотки крови позволяли свернуться и центрифугировали при 3500 об/ мин, 6 мин. Сыворотку разливали по пробиркам типа Эппендорф, замораживали и хранили при -30 °С. Антитела к вирусу эпидемического паротита определяли методом ИФА на наборе «ВектоПаротит-IgG» (АО «Вектор-Бест», г. Новосибирск, Россия), согласно инструкции производителя. Результаты выражали в коэффициентах позитивности (КП). Результат, превышающий 1,1 КП, расценивали как положительный.

Выделение мононуклеаров из крови осуществляли методом градиентного центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографин, ρ = 1,077 (ООО «ПанЭко», Россия), после отмывки добавляли 1 мл среды RPMI-1640 с добавками (2 мМ L-глютамина, гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки). Т-клеточный иммунитет определяли двумя разными способами.

Первый способ (оценка клеточного иммунитета методом ELISpot): клетки контрольной пробы в количестве 2,5 × 10⁵ вносили в лунку 96-луночного планшета набора для определения IFNγ методом ELISpot (Human IFNγ ELISpot, Mabtech, Швеция) и инкубировали при 37 °C во влажной атмосфере и 5% CO₂ 20 часов. Для стимуляции антигеном вируса эпидемического паротита клетки в той же концентрации вносили в предварительно простирилизованную с помощью 30-минутного ультрафиолетового облучения лунку панели от набора для определения IgG-антител методом ИФА, на дне которой сорбированы антигены вируса эпидемического паротита. Был использован набор «ВектоПаротит-IgG» (АО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Клетки инкубировали при 37 °C во влажной атмосфере и 5% CO₂ 4 часа. Ранее было показано, что этого времени достаточно для того, чтобы моноциты собрали антиген. Затем клетки ресуспендировали и переносили в лунки от набора для ELISpot и инкубировали еще 16 часов при тех же условиях. После этого жидкость из лунок удаляли и промывали 5 раз забуференным фосфатами физиологическим раствором (ЗФР) по 200 мкл на лунку. Конъюгат из набора разводили в бессывороточной среде RPMI-1640, вносили по 100 мкл на лунку и инкубировали при комнатной температуре 2 часа и повторно отмывали 5 раз ЗФР. ТМБ-субстрат из набора вносили по 100 мкл на лунку и инкубировали в темноте при комнатной температуре до появления видимых пятен. Содержимое лунок удаляли, промывали 2 раза деионизированной водой, затем проточной водой, затем снимали поддон и промывали мембрану с обратной стороны. Высушивали на фильтровальной бумаге в темноте при комнатной температуре. Подсчет результатов осуществляли с помощью ELISpot-ридера (AID GmbH, Германия). Встроенная в прибор программа позволяет автоматически посчитать количество пятен в каждой лунке, а также определить суммарную площадь и интенсивность окраски пятен и пересчитать в концентрацию IFNγ в каждой лунке. Результаты выражали как отношение количества пятен или концентрации IFNγ в опытной лунке к соответствующему результату в контрольной лунке.

Второй способ: для контрольной пробы клетки в количестве 2,5 × 10⁵ вносили в лунку стерильного 96-луночного планшета с добавлением раствора моненсина в конечной концентрации 10 мкМ и моноклональных антител к антигену CD107a-PE-Cy5 в конечном разведении 1:100. Стимуляцию клеток антигеном вируса эпидемического паротита осуществляли так же как описано в способе 1. Контрольную и опытную пробы инкубировали при 37 °C во влажной атмосфере и 5% CO₂ 20 часов. Затем клетки ресуспендировали, переносили в пробирки для цитометрии и окрашивали антителами к антигену CD8-FITC 20 минут в темноте при 4 °C, отмывали центрифугированием (300 g 5 мин) в растворе CellWash и подвергали фенотипированию с помощью проточного цитометра BD FACS Canto II (технологии и программное обеспечение Becton Dickinson, США). В процессе анализа выделяли лимфоидный гейт, в нем в режиме FITC-SSS выделяли гейт лимфоцитов высоко экспрессирующих антиген CD8 (CD8^hi) – это субпопуляция цитотоксических Т-лимфоцитов. Далее на графике CD107a-РЕ-Су5 против CD8-FITC подсчитывали процент дважды положительных клеток. Это число отражает процент цитотоксических Т-лимфоцитов, специфически распознавших антигены вируса эпидемического паротита.

Результаты экспериментов были исследованы на нормальность распределения по методу Колмогорова–Смирнова. Для параметров, удовлетворяющих критерию нормальности распределения, результаты представлены в виде средней арифметической и ее ошибки (M±SE). Для параметров, не подчиняющихся нормальному распределению, результаты представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей (Me (Q_0,25-Q_0,75). Уровень p < 0,05 считали значимым. Корреляцию оценивали методом Пирсона.

Результаты и обсуждение

На первом этапе у всех 37 взрослых групп 1 и 2 были исследованы сыворотки крови на наличие IgG-антител к антигенам вируса эпидемического паротита. В группе 2 все 17 человек оказались серонегативными. В группе 1 у 2 из 20 человек (10%) не обнаружили IgG-антител к антигенам вируса эпидемического паротита, а 18 человек имели такие антитела разного уровня. При определении клеточного иммунитета методом ELISpot ни у одного человека из группы 2 не обнаружено иммунного ответа на антигены вируса эпидемического паротита. В группе 1 у всех 20 человек был выявлен иммунный ответ на антигены эпидемического паротита разного уровня. Результат оценивали как отношение параметра в опытной лунке к контрольной. Программное обеспечение прибора для подсчета результатов ELISpot позволяет не только подсчитать количество пятен/клеток-продуцентов IFNγ, но также рассчитать уровень продукции этого цитокина, исходя их суммарной площади пятен и интенсивности окраски. У большинства испытуемых относительный уровень количества пятен и концентрации IFNγ практически совпадал, но у 2 человек уровень IFNγ был существенно выше, чем количество пятен 16,2/7,74 и 22,8/8,36 соответственно. Это связано с тем, что пятна у этих людей были крупные и интенсивно окрашенные, поэтому суммарный уровень IFNγ был очень высокий. Этот факт свидетельствует о том, что следует учитывать оба параметра: и количество продуцентов, и суммарный уровень продукции IFNγ. По количеству клеток-продуцентов IFNγ обследованные были разделены на 2 подгруппы: с высоким уровнем клеточного ответа (9,44±1,27, 10 чел.) и низким уровнем (3,44±0,54, 10 чел.). При оценке клеточного иммунитета к вирусу эпидемического паротита по экспрессии CD107a на CD8^hi лимфоцитах в группе 2 также не было выявлено иммунного ответа на исследованный антиген. В группе 1 клеточный ответ на антигены вируса эпидемического паротита практически отсутствовал (не превышал уровень cut-off = 1%) у 4 человек из 20 (20%), при этом у двоих из них был выявлен максимально высокий уровень, у одного – средний и еще у одного – низкий уровень IgG-антител к вирусу эпидемического паротита. У остальных обследованных людей был обнаружен клеточный ответ разного уровня (рис. 1). С помощью ROC-анализа был рассчитан уровень cut-off = 3,76%, разделяющий со 100%-ной чувствительностью и специфичностью высокий и низкий уровень клеточного ответа на антигены вируса паротита. При этом у 12 человек (60%) был идентифицирован высокий уровень Т-клеточного иммунного ответа (13,34 (7,72-14,24) %), а у 4 (20%) – низкий (2,35 (1,9-2,86) %). У двух человек группы 1, у которых не было выявлено IgG-антител к антигенам вируса эпидемического паротита, был обнаружен высокий клеточный ответ.

 

Рисунок 1. Сопоставление гуморального и клеточного иммунитета к антигенам вируса эпидемического паротита у переболевших

Figure 1. Comparison of humoral and cellular immunity to the mumps virus antigens in reconvalescents

 

Сравнение метода ELISpot и определения экспрессии молекул CD107a на CD8^hi показало отрицательную корреляцию r = -0,81. У 4 обследованных оба метода выявили высокий клеточный ответ, у 2 людей – оба метода показали низкий ответ, при этом у 6 человек ELISpot обнаружил высокий, а по экспрессии CD107a – низкий ответ, тогда как у 8, наоборот, CD107a выявил высокий уровень, а ELISpot – низкий. Это связано, во-первых, с разными популяциями, участвующими в реакциях клеточного иммунитета, выявляемыми этими двумя методами. ELISpot – Th1, CD8⁺, NK-, NKT- и γδТ-клетки, а по экспрессии CD107a – только CD8⁺ лимфоциты. А, во-вторых, в ELISpot оцениваются продуценты IFNγ, а по экспрессии CD107a – клетки, ответившие на распознавание антигена цитотоксической атакой. Не все CD8⁺ продуценты IFNγ участвуют в цитотоксической атаке и наоборот.

Хотя абсолютного иммунного коррелята защиты от эпидемического паротита не существует, уровень нейтрализующих антител считается показателем защиты, однако выявлено постепенное истощение уровня поствакцинальных антител [9]. На этом фоне клеточные иммунные реакции могут оказаться важными для предотвращения заболевания. Было показано, что Т- и В-клеточные ответы формируются и сохраняются независимо друг от друга [2]. Разные группы авторов использовали различные подходы для оценки клеточного иммунитета, но из-за методических особенностей и различий в формировании обследованных групп сложно сопоставлять такие результаты. Так, исследовали клеточный иммунитет методом ELISpot [10], однако использовали для стимуляции живой вирус паротита, который обладает цитопатическим действием, что затрудняет оценку результатов. Также оценивали клеточный иммунитет по уровню CD107a на цитотоксических лимфоцитах, но стимуляцию проводили в цельной крови с последующим лизированием, что приводило к неспецифической сорбции антигена на форменных элементах крови и последующей неспецифической стимуляции дегрануляции, а в результате опытная проба почти не отличалась от контрольной [11]. Предполагают, что Т-клеточные иммунные ответы, сформированные в результате вакцинации, уступают в эффективности постинфекционным, однако из-за малого количества обследованных такие различия могут быть результатом межиндивидуальных особенностей иммунной системы обследуемых [7]. Тем не менее изучение клеточных иммунных ответов на антигены вируса эпидемического паротита остается актуальной темой для исследования.

Заключение

По результатам нашей работы можно заключить, что оба изученных нами метода пригодны для исследования клеточного иммунитета на антигены вирусов паротита. Рассчитанный уровень cut-off (3,76%) позволяет разделять высокий и низкий ответ цитотоксических CD8⁺ лимфоцитов на антигены вируса паротита. Отрицательная корреляция между результатами, полученными данными методами, свидетельствует о том, что они выявляют разные субпопуляции, участвующие в клеточном ответе. Если ELISpot выявляет продуцентов IFNγ, то метод оценки субпопуляции CD8^hiCD107a⁺ определяет именно цитотоксические CD8⁺ лимфоциты, распознающие антигены вируса паротита. А именно они и осуществляют защитную функцию Т-клеточного иммунитета.

About the authors

P. E. Zherdeva

G. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology

Email: toptyginaanna@rambler.ru

Researcher, Laboratory of Applied Immunochemistry

Russian Federation, Moscow

Anna P. Toptygina

G. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology; Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: toptyginaanna@rambler.ru

PhD, MD (Medicine), Chief Researcher, Head, Laboratory of Cytokines; Professor, Department of Immunology, Faculty of Biology

Russian Federation, Moscow; Moscow

E. L. Semikina

National Medical Research Center of Children’s Health; I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: toptyginaanna@rambler.ru

PhD, MD (Medicine), Chief Researcher, Head, Laboratory Department; Professor, Department of Pediatrics and Pediatric Rheumatology, Pediatric Faculty

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files