Autoantibodies to lymphocytes and their relationship to the number of CD4 T lymphocytes in HIV infection

Full Text

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (FEWS-2024-0002).

Введение

Вирусы могут индуцировать аутоиммунные заболевания [9]. Целый ряд феноменов при ВИЧ-инфекции, таких как глубокое истощение CD4 Т-лимфоцитов при малом количестве зараженных CD4 Т-лимфоцитов в крови и лимфоузлах, часто отсутствие связи между вирусной нагрузкой и количеством CD4 Т-лимфоцитов в крови, неотвечаемость CD4 Т-лимфоцитарного звена некоторых больных на антиретровирусную терапию позволяет предполагать, что цитопатическое действие вируса на CD4-лимфоциты – не единственный фактор их гибели [1, 6, 7, 8, 10, 11]. На самых ранних этапах изучения ВИЧ-инфекции была предложена аутоиммунная гипотеза СПИДа, объясняющая гибель незараженных CD4 Т-лимфоцитов аутоиммунной реакцией [5]. В пользу аутоиммунной гипотезы СПИДа служат следующие факты. Свободные и мембраносвязанные IgG-аутоантитела на CD4 Т-лимфоцитах обнаруживаются у ВИЧ-инфицированных людей, в том числе в острый период, до сероконверсии [7, 8, 10]. Kuwata и соавт. на модели ВИО-инфекции у макак-резус продемонстрировали, что снижение CD4 Т-клеток ассоциировано с антителами против CD4 Т-клеток, уровень которых коррелирует со степенью истощения CD4 Т-клеток [6]. Высокий уровень анти-CD4 антител коррелирует с замедленным восстановлением количества CD4 T-клеток у иммунологических нереспондеров (лиц, имеющих низкий уровень CD4 T-клеток, несмотря на продолжительную АРВТ) [7]. Показано, что поверхностно-связанные, а также свободные аутоантитела к CD4 T-клеткам, ассоциированы с индукцией апоптоза CD4 T-клеток у ВИЧ-инфицированных пациентов [7, 8].

Т-клеточный ответ против CD4 также обнаруживается у ВИЧ+ людей. Abulafia-Lapid и соавт. сообщают, что 80% ВИЧ-инфицированных пациентов имеют пролиферативный ответ Т-клеток на CD4 in vitro [1]. Yamamura и соавт. показали наличие анти-CD4 цитотоксической активности у ВИЧ-инфицированных людей, направленной не только на инфицированные, но и на незараженные вирусом CD4 Т-лимфоциты [11].

Механизм индукции аутореактивных анти-CD4-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции также был выявлен. Анти-СD4 лимфоциты активируются через идиотип-антиидиотипические взаимодействия c лимфоцитами против CD4-связывающего домена gp120 ВИЧ [3, 4, 5].

Несмотря на то, что аутоиммунная гипотеза СПИДа обоснована многими фактами, она не является общепринятой. Причинами являются частое отсутствие специфичности рекомбинантных CD4-белков к ассоциированным с ВИЧ-инфекцией аутоантителам против CD4, что в случае использования данных белков для детекции аутоантител может приводить к ложным выводам об отсутствии аутоиммунной реакции к CD4, а также отсутствие простых и надежных методов изучения клеточных аутоиммунных реакций против CD4 у больных. Кроме того, ассоциация между аутоантителами к CD4 и количеством CD4-лимфоцитов в крови может не выявляться в связи с тем, что антитела не самостоятельно, а при участии кофакторов (лигандов молекул активации), реализуют цитопатическое действие в отношении CD4-клеток.

Целью работы было исследование аутоиммунных реакций к CD4 Т-лимфоцитам у ВИЧ-инфицированных пациентов. В качестве антигенов для выявления антител были апробированы аллогенные лимфоциты здоровых доноров и собственные аутологичные лимфоциты.

Материалы и методы

Исследование проводилось на базе БУЗ УР «Удмуртский республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями» (г. Ижевск, Россия). Были изучены образцы крови 45 ВИЧ-инфицированных больных и 26 здоровых доноров. У всех участников исследования были взяты письменные информационные согласия.

Для детекции антилимфоцитарных антител в плазме ВИЧ-инфицированных больных были использованы аллолимфоциты, полученные от здоровых доноров, и аутолимфоциты. К суспензии мононуклеаров, выделенных из крови центрифугированием в градиенте плотности, добавляли 500 мкл исследуемой плазмы, разведенной в 10 раз. В плазме предварительно инактивировали комплемент. Инкубировали 30 мин при комнатной температуре. К отмытым трижды в ЗФР мононуклеарам добавляли антитела мыши против IgG человека, меченные ФИТЦ (ООО «ИМТЕК», Россия). Инкубировали 30 мин при комнатной температуре. С помощью проточного цитометра подсчитывали процент Ig⁺ клеток среди 10 000 лимфоцитов.

Количество CD4 Т-лимфоцитов в крови ВИЧ-инфицированных больных определяли с помощью готовых к работе наборов (BeckmanCoulter, США) на проточном цитометре EPICSXL4-MCL (Beckman Coulter, США).

Статистический анализ результатов проводили с помощью программы GraphPad Prism 8.4, различия считали значимыми при p ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение

Антитела к аллогенным лимфоцитам были исследованы в образцах плазмы 25 ВИЧ-инфицированных пациентов (64% из них находились на АРВТ по схеме 1 ряда EFV + 3TC + TDF), а также 15 здоровых лиц. Уровень антител к аллогенным лимфоцитам выражали в % лимфоцитов, связавших антитела из исследуемого образца плазмы. За пороговое значение, выше которого плазму считали положительной на антитела к лимфоцитам, было принято значение уровня антител к аллогенным лимфоцитам, рассчитанное как среднее значение лимфоцитов здоровых доноров, связавших аллогенные антитела из образцов плазмы здоровых доноров, ±3 SD. Оно составило 18,8% лимфоцитов (рис. 1A).

 

Рисунок 1. А – антилимфоцитарные аллоантитела. Б – число CD4 Т-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных больных, имеющих и не имеющих антитела к аллогенным лимфоцитам в плазме крови. В – пул мембраносвязанных и свободных антилимфоцитарных аутоантител. Г – число CD4 Т-лимфоцитов в крови ВИЧ-инфицированных больных, имеющих и не имеющих антилимфоцитарные аутоантитела

Примечание. Представлены индивидуальные значения. Пунктирной линией обозначено пороговое значение, выше которого плазма крови считалась содержащей антитела.

Figure 1. A, anti-lymphocytic alloantibodies. B, the number of CD4 T lymphocytes in HIV-infected patients positive and negative for antibodies to allogeneic lymphocytes in blood plasma. C, a pool of membrane–bound and soluble anti-lymphocytic autoantibodies. D, the number of CD4 T lymphocytes in the blood of HIV-infected patients positive and negative for anti-lymphocytic autoantibodies

Note. Individual values are presented. The dotted line indicates the threshold value above which the blood plasma was considered to contain antibodies.

 

Антитела к аллогенным лимфоцитам были найдены у 33% ВИЧ-инфицированных людей (рис. 1A). Сравнительный анализ количества CD4 Т-лимфоцитов в крови ВИЧ-инфицированных, имеющих антитела к аллогенным лимфоцитам и не имеющих таковых, показал, что количество CD4 Т-лимфоцитов в крови ВИЧ-инфицированных, имеющих антитела к аллогенным лимфоцитам, достоверно ниже, чем в крови ВИЧ-инфицированных, у которых данные антитела не выявлены (рис. 1Б).

Аутоантитела против лимфоцитов, мембраносвязанные и свободные, были изучены у 20 ВИЧ-инфицированных пациентов (45% из них находились на АРВТ по схеме 1-го ряда EFV+3TC+TDF) и 11 здоровых людей. Уровень мембраносвязанных аутоантител к лимфоцитам выражали в % лимфоцитов, несущих поверхностные аутоантитела класса G. Пороговое значение, выше которого образец считали положительным на мембраносвязанные аутоантитела, составило 12,8% лимфоцитов. Мембраносвязанные антилимфоцитарные аутоантитела выявлены у 10% ВИЧ-инфицированных людей.

У тех же 20 ВИЧ-инфицированных пациентов и 11 здоровых людей были исследованы антилимфоцитарные аутоантитела, представляющие собой совокупный пул свободных (плазменных) и мембраносвязанных аутоантител. Пороговое значение для пула аутоантител к лимфоцитам составило 15,4% лимфоцитов (рис. 1В). Антилимфоцитарные аутоантитела были выявлены у 50% ВИЧ-инфицированных (рис. 1В). Следовательно, большая часть аутоантител к лимфоцитам находится в плазме крови в свободном виде.

Количество CD4 Т-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных, имеющих антилимфоцитарные аутоантитела, оказалось ниже, чем у ВИЧ-инфицированных, не имеющих данных аутоантител (рис. 1Г). Однако различие количества CD4 Т-клеток не было значимым: p = 0,079, t test (рис. 1Г). Известно, что антиретровирусная терапия обычно эффективна у большинства пациентов и позволяет восстанавливать и поддерживать количество CD4 Т-лимфоцитов [2]. Чтобы оценить влияние этих двух факторов (АРВТ и аутоантител) на количество CD4 Т-лимфоцитов был применен двухфакторный дисперсионный анализ (two-way analysis of variance, ANOVA). ВИЧ-позитивные пациенты были поделены на четыре группы: пациенты, не принимающие АРВТ и имеющие антилимфоцитарные аутоантитела (АРВТ-, аутоАт+), пациенты, не принимающие АРВТ и не имеющие антилимфоцитарных аутоантител (АРВТ-, аутоАт-), пациенты, принимающие АРВТ и имеющие антилимфоцитарные аутоантитела (АРВТ+, аутоАт+), пациенты, принимающие АРВТ и не имеющие антилимфоцитарных аутоантител (АРВТ+, аутоАт-). Наименьшее число CD4 Т-клеток наблюдалось у больных, имеющих антилимфоцитарные аутоантитела и не принимающих АРВТ, а наибольшее количество CD4 Т-лимфоцитов в крови у людей, находящихся на АРВТ и не имеющих антилимфоцитарные аутоантитела (рис. 2). Различия между этими группами значимы (p = 0,047, two-way ANOVA). Двухфакторный дисперсионный анализ выявил, что и аутоантитела к лимфоцитам и АРВТ оказывают значимое влияние на количество CD4 Т-лимфоцитов в крови (p = 0,045 и p = 0,050 соответственно, two-way ANOVA).

 

Рисунок 2. Число CD4 Т-лимфоцитов в крови ВИЧ-инфицированных больных, принимающих и не принимающих АРВТ, имеющих и не имеющих антилимфоцитарные аутоантитела в плазме крови

Примечание. Представлены индивидуальные значения.

Figure 2. The number of CD4 T lymphocytes in the blood of HIV-infected patients taking and not taking ART, positive and negative for anti-lymphocytic autoantibodies in blood plasma

Note. Individual values are presented.

 

Заключение

В плазме крови ВИЧ-инфицированных выявлены аутоантитела к лимфоцитам, и они оказывают значимое влияние на количество CD4 Т-лимфоцитов в крови. Для выявления антилимфоцитарных аутоантител, ассоциированных с ВИЧ-инфекцией и оказывающих влияние на уровень CD4-лимфоцитов, можно использовать метод связывания антител с аутолимфоцитами с последующей детекцией антивидовыми антителами методом проточной цитофлуориметрии.

About the authors

A. Ya. Snigirev

Udmurt State University

Email: khratat@mail.ru

Postgraduate Student, Department of Immunology and Cell Biology

Russian Federation, Izhevsk, Udmurt Republic

Tatyana V. Khramova

Udmurt State University; Udmurt Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: khratat@mail.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Molecular and Cell Immunology; Senior Researcher, Laboratory of Biocompatible Materials

Russian Federation, Izhevsk, Udmurt Republic; Izhevsk, Udmurt Republic

I. V. Menshikov

Udmurt State University; Udmurt Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: khratat@mail.ru

PhD, MD (Biology), Professor, Leading Researcher, Laboratory of Molecular and Cell Immunology; Chief Researcher, Laboratory of Biocompatible Materials

Russian Federation, Izhevsk, Udmurt Republic; Izhevsk, Udmurt Republic

References

Supplementary files