Effect of kisspeptin on mononuclear cell apoptosis, phagocytic activity of monocytes and neutrophils in pregnancy

Full Text

Введение

Беременность представляет собой феномен естественной полуаллогенной трансплантации, поскольку плод наполовину чужероден в силу экспрессии отцовских антигенов [1]. При беременности происходит перестройка иммунной системы матери, связанная с формированием специфической иммунной толерантности, направленной на сохранение плода от неблагоприятных иммунных реакций матери и защиту матери и плода от патогенов [1]. Супрессия адаптивного иммунного ответа матери компенсируется повышением естественного иммунитета, основными эффекторами которого являются нейтрофилы и моноциты/макрофаги [3, 4]. Увеличивается количество лейкоцитов за счет нейтрофилов и моноцитов/макрофагов, изменяется функциональная активность данных клеток [3, 4]. Моноциты и макрофаги в плацентарном ложе осуществляют клиренсную функцию [1], являются основным источником цитокинов, способствующих Th2 доминированию и определяют вид иммунного реагирования [4]. Нейтрофилы характеризуются снижением фагоцитарной, бактерицидной активности, установлена прямая связь между выраженностью этого угнетения и течением беременности [5]. В период беременности важная роль отводится апоптозу – запрограммированной клеточной гибели. Помимо элиминации поврежденных, мутантных клеток, посредством апоптоза реализуются процессы дифференцировки и морфогенеза при формировании тканей и органов, осуществляется поддержание клеточного гомеостаза организма и защита от патогенов [6].

Важную роль в этой перестройке играют гормоны беременности, оказывающие регулирующее влияние на клетки иммунной системы матери [7]. Кисспептины образуют семейство пептидов, продуцируются нейронами гипоталамуса и стимулируют секрецию гонадотропин-рилизинг-гормона [8], играя важную роль в репродукции человека, практически не попадая в системный кровоток [8]. Во время беременности кисспептины продуцируются синцитиотрофобластом плаценты [8] и могут оказывать системные эффекты на лейкоциты женщины, в силу экспрессии специфического рецептора кисспептина (KISS-1R), относящегося к классу G_αq ассоциированных рецепторов [9]. Основной формой циркулирующего гормона является кисспептин-54 [9]. Концентрации кисспептина-54 в крови составляют: 1,3 pM в первом, 4,6 pM во втором и 9,6 pM в третьем триместрах беременности [8]. Уровень киссептина-54 в крови является маркеров успешной беременности.

Ранее нами установлено, что кисспептин-54 является физиологическим регулятором системной девиации основных эффекторных и регуляторных субпопуляций Т-клеток (Th17, Treg). Мы показали, что на уровне клеток адаптивного иммунитета кисспептин-54 способствует формированию иммунной толерантности к антигенам плода, что в конечном итоге определяет успешность гестационного процесса [10]. Однако данные об иммуномодулирующем действии кисспептина-54 на функциональную активность клеток неспецифической резистентности отсутствуют. Цель работы – оценка влияния кисспептина-54 в концентрациях, характерных для физиологической беременности, на фагоцитарную активность моноцитов и нейтрофилов, а также апоптоз мононуклеарных клеток периферической крови женщин.

Материалы и методы

Кисспептин (Кисспептин-54, Metastin, CALBIOCHEM, США) использовали в физиологических концентрациях, соответствующих его уровню в периферической крови в I, II и III триместрах беременности (1,3 pM, 4,6 pM и 9,6 pM) [8]. Объект исследования: мононуклеарные клетки периферической крови (МПК), сепарированные моноциты и нейтрофилы, от 10 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (от 23 до 32 лет). Венозную кровь забирали в фолликулярную фазу менструального цикла (5-11-й день), так как экспрессия KiSS-1R максимум в этот период [8]. Исследование проводилось согласно Хельсинкской декларации, получено одобрение комитета по этике ИЭГМ УрО РАН. Критериями включения явились добровольное информированное согласие и отсутствие приема гормональных препаратов.

МПК и нейтрофилы периферической крови получали центрифугированием на двойном градиенте плотности Фиколл–Урографина (Bayer Schering Pharma AG, Германия). Плотности верхнего и нижнего градиентов составили 1,077 и 1,112 г/см³, соответственно. МПК собирали из верхней интерфазы, а нейтрофилы из нижней. Для выделения моноцитов суспензию МПК помещали в пластиковые чашки Петри с 5%-ной фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma, США) и инкубировали 45 минут при 37 °C и 5% CO₂. Адгезированные моноциты снимали, промывали RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, США), и для стабилизации моноциты инкубировали 45 минут при 4 °C и 5% CO₂ [11]. Чистота выделения моноцитов, оцениваемая с использованием моноклональных антител к CD14 (Primary Anti-Human CD14, ICN Ph., США), составляла 78-85%. Жизнеспособность клеток, определяемая по включению витального красителя эозина (0,01%) (Sigma, США), составляла 93-98%. Культивирование выделенных МПК, моноцитов и нейтрофилов (10⁶ кл/мл) с гормоном осуществлялось в полной питательной среде (ППС): RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, США), 10% FBS (Sigma, США), 10 мМ Hepes (ICN Pharmaceuticals, США), 2 мМ L-глутамин (ICN Pharmaceuticals, США) и 100 мкг/мл гентамицин (KRKA, Словения) 1 час при 37 °С. В контрольные пробы вносили растворитель гормона (0,9% NaCl).

Определение фагоцитарной активности нейтрофилов/моноцитов оценивали по описанной ранее методике [12]. Бактерии люминесцентного генно-инженерного штамма E. coli K12 TG1 lux⁺, несущих lux-оперон морской люминесцентной бактерии V. fischeri обладают способностью к биолюминесценции, которая гасится в процессе поглощения их фагоцитами. Моноциты/нейтрофилы, предварительно проинкубированные с гормоном, центрифугировали, удаляли супернатанты, доводили до нужного объема раствором Хенкса. Лиофилизированную E. coli K12 TG1 lux⁺ регидротировали в 0,89% NaCl. Затем моноциты/нейтрофилы (160 мкл, 10⁶ кл/мл) смешивали с 40 мкл реакционной смеси (20 мкл E. coli K12 TG1 lux⁺ 10⁸ клетка/мл, 20 мкл пула сыворотки для опсонизации) в белых 96-луночных планшетах. Биолюминесценцию бактериально-фагоцитарной смеси оценивали при 37 °С в течение 30 мин с помощью микропланшетного фотометра (Synergy H1, BioTek, США) с 5-мин инервалом. Рассчитывали индекс фагоцитарной активности (ИФА), отражающий процент тушения биолюминесценции по сравнению с исходным уровнем: ИФА = ((X1-X2)/X1) × 100, где Х₁ – интенсивность биолюминесценции исходного уровня свечения, Х₂ – интенсивность биолюминесценции проб (бактерии + нейтрофилы/моноциты).

Апоптоз лимфоцитов оценивали в суспензии МПК путем окрашивания аннексином-V (AnV-FITC, Caltag, США) и йодистым пропидием (PI, eBioscience, США). Определяли клетки находящиеся в ранней (AnV⁺/PI^-) и поздней стадиях (AnV⁺/PI⁺) апоптоза [13]. Индуктором апоптоза служил дексаметазон (10^-6 М, KRKA, Словения), который вносили в культуры за 30 мин до гормона. Контролем служили пробы с дексаметазоном. Клетки инкубировали 24 ч в ППС, при 37 °С и 5%СО₂. Результаты учитывали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Определение количества клеток на ранней и поздней стадиях апоптоза проводили в выделенном гейте лимфоцитов.

Полученные данные обрабатывали при помощи вариационной статистики. Вычисляли среднее арифметическое и ошибку среднего (М±m). Нормальность распределения данных контролировалась критерием Фишера. Учитывая, что во всех тестах распределение было нормальным, достоверность различий между средними величинами оценивали парным t-критерием Стьюдента. Различия считались значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Часовая инкубация обогащенной моноцитами клеточной суспензии с кисспептином-54 в концентрации, соответствующей III триместру беременности (9,6 pM), достоверно стимулирует процесс поглощения опсонизированных E. coli K12 TG1 lux⁺ на протяжении всего времени регистрации фагоцитоза. В других концентрациях гормон не оказывал статистически значимого действия (табл. 1). Инкубация нейтрофилов с гормоном показала, что кисспептин-54 в концентрации, соответствующей I триместру беременности, снижает фагоцитарную активность нейтрофилов в динамике всего исследования, а в концентрациях, соответствующих II и III триместру, только с 20 мин исследования (табл. 1).

 

Таблица 1. Влияние кисспептина-54 на фагоцитарную активность моноцитов и нейтрофилов

Table 1. Effect of kisspeptin-54 on the phagocytic activity of monocytes and neutrophils

Эксперимент. воздействие Experimental impact (n = 10)	Фагоцитарный индекс, % / Phagocytic index, %
	0 мин 0 min	10 мин 10 min	15 мин 15 min	20 мин 20 min	25 мин 25 min	30 мин 30 min
Моноциты / Monocytes
Контроль Control	19,5±3,8	21,8±5,1	33,1±2,7	43,5±1,1	45,5±1,9	53,9±2,3
Кисспептин-54, 1,3 pM Kisspeptin-54, 1.3 pM	21,4±4,1	20,9±3,6	34,4±1,4	43,2±1,9	45,6±2,8	53,8±2,5
Кисспептин-54, 4,6 pM Kisspeptin-54, 4.6 pM	19,6±2,1	18,7±6,7	32,9±2,3	42,2±1,7	44,3±2,4	53,0±1,7
Кисспептин-54, 9,6 pM Kisspeptin-54, 9.6 pM	22,3±3,8 p ˂ 0,05	24,1±4,1 p ˂ 0,05	38,4±1,6 p ˂ 0,05	48,0±1,9 p ˂ 0,05	51,4±1,6 p ˂ 0,05	59,9±1,5 p ˂ 0,05
Нейтрофилы / Neutrophils
Контроль Control	38,3±1,3	47,3±1,2	58,1±1,8	62,0±1,2	78,7±1,8	80,1±2,0
Кисспептин-54, 1,3 pM Kisspeptin-54, 1.3 pM	32,6±1,8 p ˂ 0,05	38,6±1,6 p ˂ 0,05	43,5±2,7 p ˂ 0,05	41,6±2,3 p ˂ 0,05	51,5±3,2 p ˂ 0,05	52,8±1,6 p ˂ 0,05
Кисспептин-54, 4,6 pM Kisspeptin-54, 4.6 pM	39,6±2,0	49,6±2,2	56,2±0,7	55,9±1,8 p ˂ 0,05	66,7±1,7 p ˂ 0,05	65,4±1,9 p ˂ 0,05
Кисспептин-54, 9,6 pM Kisspeptin-54, 9.6 pM	40,7±1,0	50,7±3,2	57,0±0,7	56,3±1,9 p ˂ 0,05	66,3±1,4 p ˂ 0,05	66,4±2,2 p ˂ 0,05

Примечание. р – достоверность отличий от контроля, р < 0,05.

Note. p, significance of differences from control, p < 0.05

 

Гормон, вне зависимости от концентрации, приводит к достоверному увеличению МПК, находящихся в поздней стадии апоптоза. В концентрациях, характерных для II и III триместров беременности, кисспептин увеличивает процент клеток, находящиеся в стадии раннего апоптоза (табл. 2). По-видимому, малая концентрация (1,3 pM), обладая менее выраженным действием, не успевает фиксироваться в данной постановке эксперимента.

 

Таблица 2. Влияние кисспептина-54 на апоптоз МПК

Table 2. Effect of kisspeptin-54 on PBMC apoptosis

Экспериментальное воздействие Experimental impact (n = 10)	Апоптоз, % / Apoptosis, %
	An+Pr-	An+Pr+
Контроль / Control	10,60±0,82	15,69±0,96
Кисспептин-54, 1,3 pM Kisspeptin-54, 1.3 pM	12,65±0,50 p ˂ 0,05	18,12±0,18 p ˂ 0,05
Кисспептин-54, 4,6 pM Kisspeptin-54, 4.6 pM	17,88±1,23 p ˂ 0,05	17,20±0,56 p ˂ 0,05
Кисспептин-54, 9,6 pM Kisspeptin-54, 9.6 pM	15,48±0,84 p ˂ 0,05	19,71±0,99 p ˂ 0,05

Примечание. р – достоверность отличий от контроля, р < 0,05.

Note. p, significance of differences from control, p < 0.05

 

Полученные результаты показывают, что кисспептин-54 в концентрациях характерных для нормальной беременности принимает непосредственное участие в регулировании фагоцитарной активности нейтрофилов/моноцитов периферической крови. Важно отметить, что направленность действия гормона зависит от типа фагоцитирующих клеток. Так, на фагоцитарную активность моноцитов, являющихся основными эффекторно-регуляторными клетками маточно-плацентарного компартмента, реализующих защитные и фетотрофические функции, кисспептин-54 оказывает стимулирующее действие. Напротив, нейтрофилы, чей повышенный фагоцитарный потенциал в период беременности может иметь фатальные последствия для развития плода [4], угнетаются под воздействием кисспептина-54.

И моноциты, и нейтрофилы экспрессируют KISS-1R. При связывании KISS-1R на поверхности клеток с гормоном активируется фосфолипаза С, образуются вторичные посредники, повышающие внутриклеточный Ca²⁺ [9], уровень которого и определяет активацию процессов поглощения опсонизированных бактерий [2]. Снижение фагоцитарной активности нейтрофилов или полное отсутствие эффекта кисспептина-54 можно объяснить гормон-обусловленным апоптозом нейтрофилов. Нейтрофилы – это терминально дифференцированные, короткоживущие клетки, запрограммированые на апоптоз, и, по-видимому, связывание кисспептина-54 на поверхности нейтрофилов с KISS-1R приводит в первую очередь к активации каспаз, которые контролируются мессенджерами этого же фосфоинозитидного обмена через фосфорилирование MEK1/2 и ERK1/2 протеинкиназ [14].

Учитывая, что инкубация кисспептина-54 с нейтрофилами составляла только 1 час, можно допустить, что снижение фагоцитарной активности нейтрофилов связано с проапоптотическим действием гормона. Исследования Stathaki с соавторами также показывают, что кисспептин-54 индуцирует апоптоз лимфоцитов in vitro [15]. Известно, что проапоптотический фенотип нейтрофилов необходим для нормальной плацентации и развития беременности [2]. Кроме этого обнаружена способность неактивированных (проапоптотических) нейтрофилов принимать участие в формировании иммунологической толерантности при беременности путем индукции Treg [2]. Таким образом, во время беременности кисспептин-54 повышает апоптоз МПК, что лежит в основе снижения фагоцитарной активности нейтрофилов и одновременно усиливает фагоцитоз моноцитов. Не исключено, что во время физиологической беременности изменения функциональной активности нейтрофилов и моноцитов определяются плацентарным синтезом гормона.

Выводы

Направленность действия кисспептина-54 на фагоцитарную активность зависит от типа фагоцитирующих клеток экспрессирующих KISS-1R. Так, гормон индуцирует апоптоз нейтрофилов, что определяет снижение фагоцитарной функции и предупреждает чрезмерную активацию данных клеток, способную причинить вред плоду и организму матери. На уровне моноцитов, являющихся основными эффекторно-регуляторными клетками маточно-плацентарного компартмента, реализующих фетотрофические функции, гормон оказывает стимулирующее действие. Таким образом, кисспептин-54 является новым, ранее не учитываемым фактором регуляции фагоцитарной активности моноцитов и нейтрофилов во время беременности, который способствует поддержанию баланса между защитой организма матери от инфекции и благоприятным развитием полуаллогенного плода.

About the authors

Olga L. Gorbunova

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: olia15_77@mail.ru

PhD (Biology), Researcher, Laboratory of Immunoregulation

Russian Federation, Perm

S. V. Shirshev

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: olia15_77@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Head, Laboratory of Immunoregulation

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files