Rheumatoid regulatory factor in the blood of rats immunized with autologous lymphocytes, activated in vitro by heterologous lymphocytes

Full Text

Введение

Отторжение трансплантата, вне зависимости от его природы, является одной из главных проблем, которая сдерживает развитие клинической трансплантологии. Приоритетной задачей в области трансплантологии и иммунологии остается поиск способов индукции иммунологической толерантности у реципиентов к трансплантатам. Наряду с исследованиями в области иммуносупрессивной терапии, в настоящее время разрабатываются альтернативные подходы к индукции иммунологической толерантности на основе клеточных технологий [2, 8]. В некоторых экспериментальных моделях на животных удалось достигнуть толерантность к аллотрансплантантам солидных органов, но последовательное формирование толерантности у пациентов все еще остается труднодостижимой целью. Установлено, что для обеспечения острого отторжения большинства аллотрансплантатов необходимы мощные адаптивные иммунные реакции, инициированные провоспалительными Т-клетками, активированными через прямые и непрямые пути во вторичных лимфоидных органах [5].

Изучение методов индукции приобретенной толерантности к естественным и искусственным антигенам невозможно без понимания механизмов формирования и поддержания в ходе онтогенеза естественной толерантности к собственным антигенам. В ряде экспериментов показано, что толерантность можно индуцировать длительным введением малых доз антигена или однократным введением большой дозы антигена [3, 6]. Также много работ посвящено роли Тreg клеткам в индукции и поддержании толерантности [9, 11, 12]. Вместе с тем активно развиваются методы тканевого типирования [7] и выявления предсуществующих донор-специфических антител [10].

Недавно открытый новый фактор регуляции аутореактивности получил название регуляторный ревматоидный фактор (регРФ). PегРФ представляет собой популяцию антиидиотипических антител, несущих дополнительную общую специфичность к Fc-фрагментам IgG, которая ассоциирована с иммуносупрессивными свойствами данных антител по отношению к аутореактивным лимфоцитам. Будучи антиидиотипическими антителами, регРФ ограничивает экспансию CD4⁺Т-лимфоцитов тем идиотипом, для которого он специфичен, в соответствии с принципом отрицательной обратной связи. Показано, что мишенью регРФ являются только активированные CD4⁺Т-лимфоциты [4]. Ранняя продукция регРФ была ассоциирована с нечувствительностью животных к экспериментально вызванным аутоиммунным реакциям [13]. Поэтому регРФ может рассматриваться как перспективная мишень для индукции приобретенной толерантности к чужеродным антигенам.

Целью нашего исследования было выяснить, можно ли индуцировать продукцию регРФ у крыс введением аутологичных лимфоцитов, активированных in vitro гетерологичным антигеном (лимфоциты мыши).

Идея эксперимента заключалась в том, что, если крысам ввести аутологичные лимфоциты, активированные гетерологичными (мышиными) лимфоцитами in vitro, это вызовет относительно раннюю продукцию регРФ в ходе иммунного ответа, по продукции которого можно судить об иммуносупрессии аутологичных лимфоцитов, активированных in vitro гетерологичными лимфоцитами. Тогда как введение гетерологичного антигена вызовет более поздний иммунный ответ.

Материалы и методы

Крысы популяции Wistar были доставлены из племенного комплекса «Рапполово» (НИЦ «Курчатовский институт» – ПИЯФ – ПЛЖ «Рапполово», Россия). Белые беспородные мыши приобретены из БУ УР «Удмуртский ветеринарно-диагностический центр» (БУ УР «УВДЦ», г. Ижевск, Россия). Эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами ARAR, Законом Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года и Директивой ЕС 2010/63/ЕС об экспериментах на животных. Применяемые протокол и процедуры были этически проверены и одобрены Комитетом по биоэтике Удмуртского государственного университета (дата 18.01.2021/No 2102).

Для проведения исследования крысы популяции Wistar были поделены на две группы. Первую группу (n = 6) иммунизировали внутривенно гетерологичными (мышиными) лимфоцитами. Кровь у мыши забирали в объеме 1-1,5 мл декапитацией с 3,8% цитратом натрия (НПП «ПанЭко», Россия), разводили до необходимого объема средой RPMI-1640 (НПП «ПанЭко», Россия), перемешали и нанесли на фиколл (ρ = 1,077) (НПП «ПанЭко», Россия) в соотношении 1:2. Центрифугировали в течение 30 мин при 1500 об/мин. Лимфоциты отобрали и отмыли в среде RPMI-1640 трижды (1 раз – при 1500 об/мин в течение 10 минут, 2 и 3 раз – при 1500 об/мин в течение 7 минут). Приготовили суспензию лимфоцитов – развели клетки от каждого образца в 1 мл среды RPMI-1640. Подсчитали количество выделенных клеток в камере Горяева, с помощью красителя трипановый синий (0,2%-ный раствор на ЗФР). Полученное количество клеток доводили до 100 мкл, иммунизировали крыс внутривенно. Проводили забор крови у крыс для получения сыворотки, в сыворотке определяли регРФ. Определение титра регРФ методом агглютинации танизированных, нагруженных гомологичным IgG эритроцитов проводили по методике [1].

Вторую группу (n = 6) иммунизировали аутологичными лимфоцитами, предварительно активированными in vitro гетерологичными (мышиными) лимфоцитами. Все этапы работы проводили в стерильных условиях под ламинаром. Кровь у мыши забрали в объеме 1-1,5 мл декапитацией, у крысы в объеме 3-5 мл методом кардиальной пункции с 3,8% цитратом натрия. Выделение лимфоцитов и подсчет клеток производили аналогично первой экспериментальной группе. В 24-луночном культуральном планшете (Corning, США) ставили смешанную культуру лимфоцитов (СКЛ), в которой содержалось по 5 × 10⁵ клеток от каждого образца лимфоцитов крысы и мыши. Так, конечная концентрация клеток в одной лунке 24-луночного культурального планшета составила 1 × 10⁶ клеток. Суспензия лимфоцитов была разлита на 4 лунки, следовательно, общее количество клеток в смешанной культуре от одной пары «крыса-мышь» составило 4 × 10⁶. Инкубировали полученные культуры в С02-инкубаторе (Eppendorf, Германия), а через 5 суток от начала культивирования вводили крысам внутривенно после доведения клеток до 100 мкл. Проводили забор крови у крыс для получения сыворотки, в сыворотке определяли регРФ. Оценку метаболической активности выполняли с помощью набора «Глюкоза ФКД» (ООО «Фармацевтика и Клиническая Диагностика», Россия). Определение титра регРФ проводили по методике [1].

Результаты и обсуждение

Измерение метаболической активности лимфоцитов по потреблению глюкозы в питательной среде после 5 дней инкубации показало, что концентрация глюкозы соответствует норме – наблюдается небольшое ее снижение в питательной среде, в среднем на 1,57 ммоль/л, что говорит об адекватной метаболической активности лимфоцитов и является позитивным фактором жизнедеятельности клеточной культуры.

При анализе жизнеспособности клеток после 5 дней инкубации было обнаружено, что процент живых клеток от общего количества клеток составляет 34-70%.

Для проверки гипотезы о том, что толерантность можно индуцировать введением животным активированных аутологичных лимфоцитов, что, в свою очередь, должно привести к повышению уровня регРФ, крысам внутривенно вводили СКЛ. Результаты измерения уровня регРФ представлены на рисунке 1.

В группе 1 можно наблюдать рост титра регРФ на 3-5-й день после начала иммунизации, далее его уровень постепенно снижается и уже не поднимается в течение всего эксперимента. График изменения уровня регРФ в группе животных, иммунизированных гетерологичными (мышиными) лимфоцитами (группа 1) (рис. 1) очень схож с графиком изменения уровня регРФ в группе животных, которым была проведена ксенотрансплантация кожи (рис. 2). В качестве ксенотрансплантанта был использован лоскут кожи мыши.

 

Рисунок 1. Уровень регРФ в крови крыс после введения гетерологичных (мышиных) лимфоцитов (группа 1), после введения аутологичных лимфоцитов, активированных in vitro гетерологичными (мышиными) лимфоцитами (группа 2)

Примечание. На рисунке представлены средние значения ± SD. Оценивали регРФ методом агглютинации танизированных, нагруженных гомологичным IgG эритроцитов.

Figure 1. The level of regRF in the blood of rats after the introduction of heterologous (mouse) lymphocytes (group 1), after the introduction of autologous lymphocytes activated in vitro by heterologous (mouse) lymphocytes (group 2)

Note. The figure shows the average values ± SD. RegRF was assessed by the agglutination method of tanized erythrocytes loaded with homologous IgG.

 

Рисунок 2. Уровень регРФ у крыс при ауто- (n = 10), алло- (n = 10) и ксенотрансплантации (n = 8) кожи в течение 28 дней эксперимента

Примечание. См. примечание к рисунку 1.

Figure 2. The level of regRF in rats with auto- (n = 10), allo- (n = 10), and xenotransplantation (n = 8) of skin during 28 days of the experiment

Note. As for Figure 1.

 

В группе 2 повышение уровня регРФ наблюдается на 5-й день от начала иммунизации (рис. 1), второе повышение отмечается на 21-й день, и титр регРФ не падает до конца наблюдения (35-й день от начала иммунизации). Кинетика регРФ в группе животных, иммунизированных аутологичными лимфоцитами, активированными in vitro гетерологичными (мышиными) лимфоцитами (группа 2) (рис. 1), схожа с кинетикой регРФ у животных, которым была проведена аутотрансплантация кожи (рис. 2).

Согласно гипотезе исследования регРФ является фактором негативной регуляции CD4⁺T-лимфоцитов и, в первую очередь, аутореактивных лимфоцитов. Соответственно, реакция на аутоантигены происходит быстрее, по аналогии со вторичным иммунным ответом, тогда как на ксенотрансплантат иммунный ответ развивается позднее, что мы и ожидали получить. Поэтому, как и при трансплантации кожи, наблюдаемая нами ранняя продукция регРФ при введении аутологичных лимфоцитов возможна по причине уже установленного иммунного контроля в отношении собственных антигенов.

Выводы

Таким образом, активированные in vitro гетерологичным антигеном аутологичные лимфоциты вызвали относительно ранний ответ регРФ, что может свидетельствовать об установлении негативного регуляторного контроля.

About the authors

Anastasia V. Kryazhevskikh

Udmurt Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; Udmurt State University

Author for correspondence.
Email: krav526@gmail.com

Research Engineer, Laboratory of Biocompatible Materials, Postgraduate Student, Department of Immunology and Cell Biology

Russian Federation, Izhevsk, Udmurt Republic; 1 Universitetskaya St., Izhevsk, Udmurt Republic, 426034

N. N. Abisheva

Udmurt Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; Udmurt State University

Email: krav526@gmail.com

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Biocompatible Materials, Senior Researcher, Laboratory of Molecular and Cellular Immunology, Associate Professor, Department of Immunology and Cell Biology

Russian Federation, Izhevsk, Udmurt Republic; 1 Universitetskaya St., Izhevsk, Udmurt Republic, 426034

References

Supplementary files