Effect of testosterone drug on RAGE and inflammatory transcription factor NF-kB in rat testicular tissue at the fructose-enriched diet

Full Text

Введение

Сахарный диабет (СД) и метаболический синдром (МС) – актуальная проблема современности в связи с распространенностью, в том числе среди мужчин молодого возраста [1]. Известно, что при СД и МС развивается нарушение половой функции, характеризующееся снижением уровня сывороточного тестостерона, наиболее выраженным у сравнительно молодых пациентов, и клиническими проявлениями у части больных в виде снижения либидо и потери эрекции [3, 6, 9].

Проведение заместительной терапии тестостероном (ЗТТ) рассматривается как один из способов коррекции гипогонадизма у таких пациентов. Такая терапия способна смягчать некоторые метаболические нарушения [13], снижать риск развития сахарного диабета 2 типа [3], в то время как данные о восстановлении сексуальной функции более противоречивы: в частности, указывается возможность неблагоприятного влияния ЗТТ на сперматогенез [7, 10].

Роль клеточных рецепторов к конечным продуктам гликирования (RAGE – Reseptor of Advanced Glycation End products) весьма разнообразна и неоднозначна в разных тканях и в контексте разных заболеваний и неблагоприятных воздействий [13]. Участие этих рецепторов и активируемого RAGE сигнального пути с возрастанием провоспалительного фактора транскрипции NF-kB в функционировании сперматозоидов при гипергликемии и действии экзогенного тестостерона остаются не до конца ясными. Возможно, RAGE могут принимать участие в нарушении половой функции у описанной категории пациентов, так как было доказано, что окислительный стресс и воспаление не только нарушают сперматогенез, но и повреждают сперматозоиды [8].

Целью исследования является оценка влияния лекарственного тестостерона на уровни RAGE и NF-kB в тестикулах крыс при СД и МС.

Материалы и методы

Эксперименты были проведены на беспородных белых крысах-самцах массой 200–250 г. Возраст крыс – 12 недель. Была использована наиболее воспроизводимая экспериментальная модель МС [4] с добавлением 20%-ного раствора фруктозы в течение 6 недель к высококалорийной диете. Кроме того, некоторым животным вводился лекарственный препарат тестостерона (омнадрен (смесь эфиров тестостерона), Pharmaceutical Works JELFA, S.A., Польша) в дозе 4 мг/кг/сут подкожно, в течение 4 недель [5]. Животных содержали в стандартных условиях вивария. При выполнении экспериментов руководствовались правилами проведения работ на экспериментальных животных (Приложение к Приказу Минздрава России от 19.06.2003 № 267). После воздействия у животных под наркозом комбинацией тилетамина и золазепама в соотношении 1:1 (Zoletil, Virbac, Франция; в дозе 10 мг/кг, 0,1 мл) извлекали семенники и замораживали их в жидком азоте, после чего хранили при температуре – 80 °С. Для получения гомогената 30-40 мг замороженной ткани семенников измельчали в гомогенизаторе Ultra Turrax (IKA T 10 basic, Германия), с последующим погружением в холодный буфер, содержащий 150 мМ NaCl; 50 мМ Трис-HCl; pH = 7,4; 1,2 мМ ЭДТА с добавлением Na₃VO₄ 20 мкл/мл; DTT 4 мкл/ мл; PMSF 20 мкл/мл; апротинин 5 мкл/мл; лейпептин 5 мкл/мл; пепстатин А 5 мкл/мл; Phosphatase Inhibitor Cocktail B 40 мкл/мл из расчёта 100 мкл буфера на одну пробу. В последующем проводили гомогенизацию и центрифугирование для получения супернатанта (в течение 10 мин при температуре 4 °С и 12 000 g).

Концентрация белка в надосадочной жидкости определялась методом Bradford на спектрофотометре UV-3600 (Shimadzu, Япония) c использованием растворов бычьего сывороточного альбумина (BSA) разной концентрации в качестве стандартных. Исследуемые образцы были выравнены по содержанию белка и хранились при -20 °C для последующего анализа методом вестерн-блоттинга.

Вестерн-блоттинг

Предварительно подготовленные образцы вводились в 4-12%-ный полиакриламидный гель, затем осуществлялся электрофорез в мини-системе Bio-Rad (США) в течение 40-60 мин при 100 В. Затем проводился перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, США) в системе mini Trans-Blot (Bio-Rad, США) в течение 1 ч при напряжении 100 В с постоянным охлаждением. Чтобы удостовериться в равном переносе белка из геля на мембрану, нитроцеллюлозная мембрана была окрашена Ponceau S. Затем проводилось блокирование мембраны в 4%-ном растворе BSA в TBS-T (TBS (TRIS-buffered saline) + 0,1 % Tween 20) при комнатной температуре в течение часа. Следующим этапом являлась инкубация мембраны с антителами кролика к белку RAGE (1:1000; Affinity Biosciences, США) и NF-kB (1:1000; Affinity Biosciences, США) в течение ночи при 4 °С. После этого отмывали мембраны в TBST 5 раз по 5 мин. Затем мембраны инкубировали в течение 1 ч с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) HRP, 1:5000; Affinity Biosciences, США). Далее проводили отмывку в TBST 5 раз по 5 мин. Детекцию мембранных полос проводили с помощью 3,3-диаминобензидина (DAB, diaminobenzidine). Для анализа полученных изображений использовали Image Lab (Bio-Rad, США). Полученный от белковых полос сигнал был нормализован к референсному белку GAPDH (антитела в разведении 1:5000, Affinity Biosciences, США).

Иммунофлуоресцентное исследование

Для иммунофлуоресцентного исследования из замороженных препаратов были приготовлены срезы толщиной 15 мкм с помощью микротома HM525 NX Cryostat (Thermo Fisher Scientific, США), которые перемещались на предметные стёкла Superfrost Plus (Thermo Fisher Scientific, США). В последующем срезы фиксировались 4%-ным раствором параформальдегида, приготовленного на фосфатно-солевом буфере (PBS, phosphate-buffered saline: 3,2 мМ NaH2PO4, 0,5 мМ K2HPO4, 1,3 мМ KCl, 135 мМ NaCl, pH = 7,4). После фиксации проводилась 3-кратная отмывка срезов буферным раствором (PBS) с последующей инкубацией в течение 60 мин. во влажной камере с раствором 1%-ного Тритона-Х100 и 5%-ного раствор BSA. Затем на срезы были нанесены растворы антител кролика, специфичных к RAGE (1:200, Affinity Biosciences, США), с последующей инкубацией в течение 1 суток и троекратной отмывкой в PBS. Следующим этапом выполнялась инкубация среза с раствором вторичных антител Alexa Fluor 488 (goat IgG, 1:300; Abcam, Великобритания) 1 часа при комнатной температуре без доступа к свету с последующей отмывкой. Ядра клеток окрашивали DAPI (Abcam, Великобритания).

Получение изображений осуществлялось при использовании устройства DS-Fi3 EF-2E, установленнного на микроскоп Nikon Eclipse E200 (Nikon, Япония); для анализа полученных изображений использовалась программа ImageJ.

Площадь просвета и стенки семенных канальцев оценивали в пикселях, затем вычисляли их отношение.

Статистическую обработку проводили в SPSS Statistica 22.0 (IBM Corp., США). Данные представлены в виде М±m, медианы, 25%и 75% квартилей, наименьшего и наибольшего значений. Для оценки статистической значимости различий в группах применяли критерий Манна–Уитни; различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

У всех крыс с моделированным МС развивалась гипергликемия (9,3±0,11 ммоль/л), но увеличение массы тела зарегистрировано не у всех животных (281,6±23,2 г).

Оценка содержания RAGE в ткани яичек разных исследуемых групп была проведена с помощью иммуноблоттинга и иммунофлуоресцентного окрашивания замороженных срезов ткани.

В нашем исследовании не установлено достоверных изменений содержания RAGE и NF-kB в тестикулярной ткани крыс при гипергликемии, хотя в литературе встречаются данные о повышении экспрессии RAGE при метаболическом синдроме в таких клетках, как эндотелий, сосудистые гладкомышечные клетки, иммунные клетки и др. [2, 12]. По-видимому, гипергликемия не вызывает, по крайней мере в течение некоторого времени, повышение экспрессии RAGE, что может быть обусловлено ограничением запуска воспалительного каскада, апоптоза и других последствий активации RAGE-инициируемых сигнальных путей в условиях временной гипергликемии, например, благодаря слущиванию RAGE с поверхности клеток и образованию растворимых форм рецептора (sRAGE), которые могут выступать в качестве рецепторов-ловушек конечных продуктов гликирования (AGEs – Advanced Glycation End products), как описано в некоторых источниках [11, 12].

Сравнительный анализ результатов вестерн-блоттинга показал, что содержание RAGE в тканях яичек исследуемых животных достоверно выше в группах МС + Tн и Tн как по отношению к контрольной группе, так и по отношению к группе МС (рис 1). Этот факт наводит на мысль, что экзогенный тестостерон, в т.ч. на фоне гипергликемии, вызывает повышение содержания RAGE в тестикулярной ткани. Предполагалось, что увеличение RAGE может привести к активации провоспалительного сигнального пути, опосредованного NF-kB, однако ни в одной из групп не обнаружено достоверных изменений содержания провоспалительного транскрипционного фактора NF-kB в семенниках (рис. 1). Вероятно, воспалительный каскад, реализуемый с участием этого фактора, не активирован в тестикулах при описанных условиях.

 

Рисунок 1. RAGE (А) и NF-kB (Б) в гомогенатах ткани яичек крыс (вестерн-блоттинг)

Примечание. К – контроль, МС – метаболический синдром, Тн – тестостерон. * – различия статистически значимы при сравнении с группой контроля и метаболического синдрома.

Figure 1. RAGE (A) and NF-kB (B) in rat testicular tissue homogenates (Western blotting)

Note. C, control; МS, metabolic syndrome; Тn, testosterone. *, differences are statistically significant when compared with the control and metabolic syndrome groups.

 

По данным иммунофлуоресцентного исследования оказалось, что интенсивность свечения RAGE в семенных канальцах достоверно выше в группе крыс, которым вводился тестостерон по сравнению с другими группами (рис. 2), что подтверждает результат вестерн-блоттинга.

 

Рисунок 2. Иммунофлуоресцентное исследование RAGE в ткани семенников крыс

Примечание. К – контроль, МС – метаболический синдром, Тн – тестостерон. А – интенсивность флуоресеценции семенных канальцев. * – различия статистически значимы при сравнении с другими группами. Б – микрофотографии семенников, увеличение ×40. Ядра клеток – синее свечение (DAPI), RAGE – зеленое свечение.

Figure 2. Immunofluorescence study of RAGE in rat testicular tissue

Note. C, control; МS, metabolic syndrome; Тn, testosterone. A, fluorescence intensity of seminiferous tubules, *, differences are statistically significant when compared with other groups. B, micrographs of testicles, magnification ×40. Cell nuclei – blue glow (DAPI), RAGE – green glow.

 

При анализе отношения площади просвета к площади стенки семенных канальцев достоверного изменения этого показателя в исследуемых группах не отмечено, что свидетельствует об отсутствии атрофии тестикулярной ткани (рис. 2). Также не получено достоверных изменений отношения массы яичек к массе тела (К – 0,011±0,002; МС – 0,010±0,003; МС + Тн – 0,013±0,006, Тн – 0,009±0,003).

Заключение

Таким образом, предварительные результаты нашего исследования демонстрируют повышение содержания RAGE при отсутствии увеличения провоспалительного транскрипционного фактора NF-kB в ткани семенников при введении тестостерона, что может является одним из патогенетических механизмов нарушения сперматогенеза, не связанных с активацией воспалительного каскада через NF-kB, при заместительной терапии тестостероном, в том числе у лиц с СД и МС.

Выводы

1. Гипергликемия в течение 6 недель не вызывает повышения уровня RAGE и NF-kB в семенниках крыс.
2. При введении лекарственного тестостерона повышается содержание RAGE в тестикулах крыс как на фоне гипергликемии, так и в интактном организме.
3. При введении тестостерона, несмотря на повышение RAGE, не реализуется активация NF-kB-зависимого провоспалительного каскада.
4. На фоне гипергликемии и, по крайней мере, в течение 4 недель лекарственного воздействия тестостероном не возникают атрофические изменения в тестикулярной ткани крыс.

About the authors

Natalya G. Ovchinina

Izhevsk State Medical Academy

Author for correspondence.
Email: ntly.82@mail.ru

PhD, (Medicine), Associate Professor, Department of Pathological Physiology and Immunology

Russian Federation, Izhevsk, Udmurt Republic

M. A. Urakova

Izhevsk State Medical Academy

Email: ntly.82@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Associate Professor, Department of Pathological Physiology and Immunology

Russian Federation, Izhevsk, Udmurt Republic

I. G. Bryndina

Izhevsk State Medical Academy

Email: ntly.82@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Pathological Physiology and Immunology

Russian Federation, Izhevsk, Udmurt Republic

A. V. Sekunov

Izhevsk State Medical Academy

Email: ntly.82@mail.ru

PhD (Medicine), Assistant Professor, Department of Pathological Physiology and Immunology

Russian Federation, Izhevsk, Udmurt Republic

V. A. Protopopov

Izhevsk State Medical Academy

Email: ntly.82@mail.ru

Assistant Professor, Department of Pathological Physiology and Immunology

Russian Federation, Izhevsk, Udmurt Republic

References

Supplementary files