Influence of cytokines on macrophage tolerance to lipopolysaccharide

Full Text

Введение

Макрофаги являются ключевыми эффекторами врожденного иммунитета и также задействованы в работе адаптивного иммунитета. При этом они способны не только напрямую фагоцитировать патогены, но также и выполнять регуляторную роль. При активации макрофаги переходят из гомеостатического фенотипа в провоспалительный для борьбы с патогеном. В то же время для восстановления гомеостаза и контроля чрезмерной воспалительной реакции организма макрофаги, напротив, могут переходить в противовоспалительный фенотип. Нарушение функции макрофагов приводит к развитию множества заболеваний воспалительного генеза.

Пластичность макрофагов заключается в различных направлениях их поляризации. В упрощенном виде существуют два подтипа макрофагов: М1 и М2, отличающиеся своими функциями. М1-макрофаги обладают провоспалительным фенотипом, продуцируя токсичные для патогенов вещества (например, активные формы кислорода и NO), воспалительные цитокины, участвуют в ответах Th1, а также подавляют пролиферацию клеток. М2, напротив, обладают противовоспалительным фенотипом, способствуют пролиферации клеток и регенерации тканей, участвуют в Th2-ответах. При этом нарушение их нормальной функции может привести к различным патологическим состояниям [5].

Важным событием в жизни макрофага является его активация при встрече с молекулярными паттернами, ассоциированными с патогенами (PAMP) или повреждением (DAMP). Данный процесс опосредуется через специальные рецепторы – PRR, к которым принадлежат Толл-подобные рецепторы (TLR). Наиболее известным среди них является TLR4, который способен связываться с липополисахаридом (LPS), основным компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

LPS индуцирует выработку различных хемокинов и про- и противовоспалительных цитокинов, таких как CCL2, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, TNFα, TGFβ и т. д. Липолисахарид бактерий, колонизирующих различные органы человека, может быть источником различных воспалительных состояний, вплоть до болезней, на первый взгляд не имеющих инфекционную этиологию, таких как атеросклероз [4].

М1-макрофаги активируются LPS и другими веществами, связанными с патогенными микроорганизмами, а также провоспалительными цитокинами TNFα и IFNγ. М2-макрофаги поляризуются противовоспалительными цитокинами (IL-4 и IL-13 для M2a-подтипа, IL-10 и TGF-β для M2c-подтипа), активацией рецепторов Fcγ и TLR (M2b), и т. д. [6]. Макрофаги могут изменять функциональный профиль под действием различных стимулов, переключаясь между типами поляризации. Так, транскриптомный анализ показал, что при последовательном изменении условий среды, т. е. добавления ЛПС, про- и противовоспалительных цитокинов, поляризованные М1-макрофаги могут переходить в фенотип М2 [6]. Также было обнаружено, что стимуляция TLR3 меняет поляризацию мышиных М2 в М1-подтип, способствуя регрессии опухоли [11]. А стимуляция TLR2-рецептора М2-макрофагов, полученных из крови человека, снижало их противовоспалительную активность, таким образом способствуя переходному М1/М2-подтипу [9]. Известно, что при повторном воздействии LPS на макрофаги, вторичный воспалительный ответ будет менее сильным – так называемое явление толерантности к липополисахариду. Толерантность к LPS может защитить организм от агрессивного воздействия провоспалительных цитокинов – цитокинового шторма, однако параллельно при этом повышается риск ослабления защиты перед патогенами. Явление толерантности к LPS задействовано в патогенезе различных хронических воспалительных заболеваний [3].

Целью нашего исследования было изучить влияние различных цитокинов и хемокинов на иммунный ответ макрофагов в условиях толерантности к липополисахариду.

Материалы и методы

Для выделения PBMC использовалась венозная кровь 3 здоровых доноров. Методом иммуномагнитной сепарации из полученных мононуклеарных клеток были выделены CD14+ моноциты. Клетки культивировались в 48-луночных планшетах (1 × 106 клеток/мл в 500 мкл) в среде в среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина (НПП «ПанЭко», Россия), пенициллин-стрептомицина (НПП «ПанЭко», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «БиолоТ», Россия) и GM-CSF (50 нг/ мл, SCI-STORE, Россия).

На 4-й день после выделения моноцитам сменяли среду на свежую для продолжения дифференцировки в макрофаги. На 6-й день к макрофагам в свежей культуральной среде добавлялся один из рекомбинатных цитокинов/хемокинов человека (10 нг/мл): (rhCCL2, rhCXCL1, rhCXCL9, rhCXCL12, rhIL-1b, rhIL-4, rhIL-6, rhIL-7, rhIL-8, rhIL-15, rhIL-22, rhTNFα). Клетки инкубировались 4 часа в присутствии цитокина/хемокина, затем после смены среды у половины клеток происходила первая стимуляция LPS E. coli (100 нг/мл, Sigma-Aldrich, США). На 7-й день после выделения LPS после 1-х суток инкубации с LPS сменялась культуральная среда (при этом кондиционированная среда замораживалась для последующего ИФА). На 11-й день происходила новая стимуляция LPS макрофагов уже во всех лунках. На 12-й день после суток инкубации с LPS собиралась среда и замораживалась для ИФА.

ИФА цитокинов в кондиционированной среде (TNFα, CCL2, IL-1b, IL-6, IL-8, IL-10) проводился с помощью наборов DuoSet ELISA Development kit (R&D Systems, США) и микропланшетного ридера Tecan Infinite F500.

Статистический анализ проводился с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок при уровне значимости p < 0,05 с помощью программы JASP 0.19.3 и GraphPad Prism 8.

Результаты и обсуждение

В ходе нашего исследования было проверено 12 рекомбинатных хемокинов и цитокинов (rhCCL2, rhCXCL1, rhCXCL9, rhCXCL12, rhIL- 1b, rhIL-4, rhIL-6, rhIL-7, rhIL-8, rhIL- 15, rhIL- 22, rhTNFα) на способность изменять иммунный ответ макрофагов при однократной (как на 6-й день после выделения, так и на 11-й день) и двукратной стимуляции LPS. Однако статистически значимые результаты были получены только для rhIL-4 и rhTNFα.

Обнаружено, что предварительная обработка макрофагов человека рекомбинантным rhIL-4 повышает секрецию TNFα, IL-6, IL-8 и IL-10 после повторной стимуляции LPS по сравнению с контролем (рис. 1).

 

Рисунок 1. Влияние rhIL-4 на толерантность макрофагов к LPS (после повторной стимуляции)

Примечание. n = 3. Результаты представлены в виде среднего и стандартного отклонения. * – различия p < 0,05 по сравнению с контролем без добавления рекомбинатного цитокина. A – значения секреции макрофагами TNFα в пкг/мл. Б – значения секреции IL-6 в пкг/мл. В – значения секреции IL-8 в пкг/мл. Г – значения секреции IL-10 в пкг/мл.

Figure 1. Effect of rhIL-4 on macrophage tolerance to LPS (after repeated stimulation)

Note. n = 3. Results are presented as mean and standard deviation. *, differences p < 0.05 compared to control without addition of recombinant cytokine. A,v alues of TNFα secretion by macrophages in pg/mL. B, values of IL-6 secretion in pg/mL. C, values of IL-8 secretion in pg/mL. D, values of IL-10 secretion in pg/mL.

 

Примечательно, что обработанные rhIL-4 макрофаги, которым на 11-й день после выделения в первый раз был добавлен LPS, также увеличивают продукцию TNFα и IL-8 по сравнению с контролем (рис. 2).

 

Рисунок 2. Влияние rhIL-4 на секрецию цитокинов макрофагами при однократной стимуляции LPS

Примечание. n = 3. Результаты представлены в виде среднего и стандартного отклонения. * – различия p < 0,05 по сравнению с контролем без добавления рекомбинатного цитокина. A – значения секреции макрофагами TNFα в пкг/мл. Б – значения секреции IL-8 в пкг/мл.

Figure 2. Effect of rhIL-4 on cytokine secretion by macrophages after a single stimulation with LPS

Note. n = 3. Results are presented as mean and standard deviation. *, differences p < 0.05 compared to the control without the addition of recombinant cytokine. A, values of TNFα secretion by macrophages in pg/mL. B, values of IL-8 secretion in pg/mL.

 

Также было выявлено, что обработка рекомбинатным rhTNFα способствует повышению концентрации TNFα в кондиционированной среде макрофагов после повторной стимуляции LPS (рис. 3).

 

Рисунок 3. Влияние rhTNFα на секрецию макрофагами TNFα при однократной стимуляции LPS

Примечание. n = 3. Результаты представлены в виде среднего и стандартного отклонения. * – различия p < 0,05 по сравнению с контролем без добавления рекомбинатного цитокина.

Figure 3. Effect of rhTNFα on TNF-α secretion by macrophages after a single LPS stimulation

Note. n = 3. Results are presented as mean and standard deviation. *, differences p < 0.05 compared to the control without the addition of recombinant cytokine.

 

Таким образом, предварительная обработка rhIL-4 и rhTNFα усиливала воспалительный ответ макрофагов при повторной стимуляции LPS по сравнению с контролем, демонстрируя снижение толерантности к эндотоксину. При этом rhIL-4 также способствовала усилению иммунного ответа при однократной стимуляции LPS.

Известно, что IL-4 способствует поляризации макрофагов в противоспалительный М2-фенотип. Согласно данным литературы, предварительная обработка макрофагов IL-4 может усиливать иммунный ответа на LPS. В работе Stout et al. (2005) было показано, что предварительная обработка IL-4 или IFNγ усиливала секрецию воспалительных цитокинов TNFα и IL-12 и подавляла продукцию IL-10 в ответ на стимуляцию LPS. Интересно, что IFNγ подавлял продукцию CCL2, а IL-4 ее усиливал [10]. В исследовании Li et al. (2023) индукция цис-аконитатдекарбоксилазы (IRG-1), опосредованная ЛПС, была нарушена как в поляризованных IFNγ макрофагах M1, так и в поляризованных IL-4 макрофагах M2 при двойной стимуляции, при этом экспрессия гемоксигеназы-1 (HO-1) была выше в М2-макрофагов. А в присутствии диметил итаконата, известного своими иммуномодулирующими свойствами, те же М2-макрофаги демонстрировали повышенную секрецию TNFα и IL-6 после стимуляции LPS [7]. Результаты нашего исследования сходятся с данными литературы, однако стимулирующий эффект IL-4 проявился также при повторной стимуляции LPS, даже сильнее, чем при однократной стимуляции, что требует более подробных исследований.

Данные литературы довольно противоречивы касательно влияния TNFα на последующую стимуляцию LPS. Например, TNFα и LPS индуцируют перекрестную толерантность в клетках линии острого моноцитарного лейкоза THP-1 [2]. На первичных макрофагах человека было показано, что предварительное воздействие TNFα вызывает толерантность к LPS через активацию фермента GSK3 [8]. Однако в исследовании Li et al. (2023) было показано, что предварительная обработка TNFα первичных макрофагов, полученных из моноцитов крови человека, повышает секрецию TNFα и IL-6, как после единичной, так и после повторной стимуляции липополисахаридом. При этом авторы утверждают, что сам TNFα не влияет на толерантность, а лишь усиливает продукцию цитокинов в ответ на стимуляцию LPS [7]. Наши результаты более схожи с результатами последней статьи, но при этом rhTNFα оказывал стимулирующий эффект только на толеризированные макрофаги. Возможно, в этом играет присутствие большой концентрации GM-CSF в среде, который также может влиять на развитие толерантности к LPS [1]. Очевидна необходимость в более подробном исследовании кросс-толерантности TNFα и LPS.

Выводы

Таким образом, данные нашего исследования показывают, что некоторые цитокины, такие как IL-4 и TNFα, способны модулировать эффективность толерантности макрофагов к липополисахариду. Однако все еще требуется более подробно изучить механизм взаимодействия цитокинов и липополисахарида в макрофагах, особенно в контексте толерантности к LPS. Исследования по данной тематике позволят создать новые подходы к лечению хронических воспалительных заболеваний.

Благодарности

Авторы благодарят Центр коллективного пользования ИБГ РАН за возможность использования научного оборудования.

About the authors

Daiana B. Erdyneeva

Research Institute of General Pathology and Pathophysiology; Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University)

Author for correspondence.
Email: daya-na@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2279-0157

Senior Laboratory Assistant, Laboratory of Angiopathology, Postgraduate Student

Russian Federation, Moscow; Dolgoprudny, Moscow Region

Nikita G. Nikiforov

Research Institute of General Pathology and Pathophysiology; Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences

Email: nikiforov.mipt@googlemail.com
ORCID iD: 0000-0002-2082-2429

PhD (Biology), Researcher, Laboratory of Angiopathology, Junior Researcher of Core Facility Center

Russian Federation, Moscow; Moscow

Svetlana S. Verkhova

Research Institute of General Pathology and Pathophysiology; B. Petrovsky Russian Research Center of Surgery

Email: verxova.svetlana@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7953-0586

Senior Laboratory Assistant, Laboratory of Angiopathology, Postgraduate Student

Russian Federation, Moscow; Moscow

Alexander N. Orekhov

Research Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: ano.inat@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6495-1628

PhD, MD (Biology), Head, Laboratory of Angiopathology

Russian Federation, Moscow

Tatyana A. Kulagova

Research Institute for Nuclear Problems, Belarusian State University

Email: tatyana_kulagova@tut.by
ORCID iD: 0000-0002-1113-7323

PhD (Biology), Researcher, Laboratory of Nanoelectromagnetism

Belarus, Minsk

References

Supplementary files