Evaluation of changed metabolite profiles in SIM-A9 microglial cells under the influence of hypoxia and lipopolysaccharide

Full Text

Введение

Нейровоспаление является одним из ключевых патогенетических факторов повреждения тканей мозга, при гипоксии-ишемии, травме и нейродегенеративных процессах различного генеза. В развитии нейровоспаления ведущую роль играют клетки микроглии, которые являются резидентными макрофагами нервной ткани. Под действием патологических факторов микроглия приобретает реактивные фенотипы, которые могут как способствовать развитию нейровоспаления, так и сдерживать этот процесс, оказывая нейрозащитное действие [6]. Активация клеток микроглии приводит к морфологическому и функциональному разделению на два условных фенотипа: провоспалительный и противовоспалительный [11]. Регуляция баланса между формированием соответствующих фенотипов является одним из ключевых факторов, определяющих глубину поражения нервной ткани под действием нейродеструктивных процессов, в частности при гипоксии-ишемии мозга.

Одним из факторов развития указанных фенотипов микроглии является метаболическое репрограммирование или изменение активности метаболических путей для того, чтобы сбалансировать потребность в энергии и строительных блоках в соответствующих условиях [9]. В ряде работ было установлено, что в условиях гипоксии-ишемии указанные фенотипы характеризуются специфическими перестройками метаболизма глюкозы, жирных кислот и ряда аминокислот. Также активно обсуждается роль метаболитов в формировании специфических фенотипов и возможности управления ими за счет модулирования метаболических путей [13]. В этой связи фенотипическое переключение микроглии может иметь несомненный терапевтический потенциал, однако детальные механизмы регуляции данного процесса с участием различных метаболитов остаются мало изученными.

При гипоксии-ишемии клетки микроглии одни из первых реагируют на повреждения нервной ткани. Выделяющиеся при разрушении клеток молекулярные паттерны повреждения (DAMPs) запускают активацию микроглии. Среди мишеней DAMPs выделяют Toll-подобные рецепторы (TLR), которые являются молекулами первой линии для инициации врожденных иммунных реакций [1]. Было показано, что TLR4 присутствует на клетках микроглии и его экспрессия повышается в условиях гипоксии, что может стимулировать процессы нейровоспаления за счет активации транскрипционного активатора NF-κB и усиления высвобождения провоспалительных цитокинов [8, 10, 14]. Таким образом, данные рецепторы играют ключевую роль в развитии нейровоспаления, однако их вклад в возможные метаболические перестройки остается до конца не изученным.

Для исследования клеточного метаболизма в последнее время активно используются технологии современной метаболомики. В частности, применение методов масс-спектрометрии позволяет проводить профилирование большого количества метаболитов для комплексной оценки изменений клеточного метаболома [12], что также может способствовать выявлению новых метаболических паттернов, участвующих в процессах нейровоспаления.

В настоящее время имеются ограниченные данные об изменении состава метаболитов и активности метаболических путей в клетках микроглии под действием нейровоспалительных факторов. В этой связи, целью данной работы явилось проведение нетаргетного метаболомного исследования для оценки изменений профилей метаболитов в клетках микроглии, подвергнутых гипоксии, а также при активации TLR4.

Материалы и методы

Для проведения метаболомных исследований в работе использовались клетки линии микроглии SIM-A9 (ATCC CRL-3265), которая была получена в результате спонтанной трансформации клеток микроглии коры головного мозга мышей линии С57Bl/6. Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей аланил-глутамин 200 мМ, HEPES 10 мМ, пеницилин-стрептомицин 0,5%, и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки инкубировали при 37 °С, в присутствии 5% СО₂. Для метаболомных исследований клетки пересевали в 6-луночный планшет, 1 × 10⁶ клеток на лунку. На следующий день клетки подвергались гипоксии или инкубировались в присутствии липополисахарида. Гипоксию проводили в миниинкубаторе, соединенном с модулем регулируемой подачи газов (OkoLab) при температуре 37 °С. Для этого клеточные среды удаляли, клетки промывали раствором Хэнкса без глюкозы и далее инкубировали в этом растворе в условиях гипоксии (О₂ 1%) 30 мин или 1 час. Далее клетки возвращали в кондиционированные среды и проводили реоксигенацию 1 и 3 часа. Клетки также инкубировали в присутствии липополисахарида (LPS) 100 нг/мл в течение 1 и 3 часов. После стрессорных воздействий проводили экстракцию метаболитов. Для этого клетки промывали фосфатно-солевым буферным раствором, затем добавляли 800 мкл ледяной смеси метанол/вода (80/20). Клетки снимали скребком, после чего полученную суспензию переносили в пробирки, тщательно перемешивали и помещали в ультразвуковую баню на 20 секунд, затем помещали в лед. Манипуляции повторяли три раза. Далее клеточный дебрис осаждали центрифугированием 20 минут, 20 000 g при 4 °C. Супернатант переносили в новые пробирки и лиофилизировали в вакуумном концентраторе при температуре 45 °С, после чего добавляли 40 мкл 80% метанола в воде.

Профили метаболитов получали в результате анализа образцов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием молекулярных ионов. Для этого использовали хроматографическую систему (UltiMate 3000, Thermo Scientific, США), сопряженную с квадруполь-времяпролетным масс-спектрометром высокого разрешения (Bruker maXis II 4G ЕТD). Хроматографию проводили на колонке ACE Excel 100 × 2,1 мм 1,7 мкм C18-PFP EXL-1710-1002U с предколонкой Waters ACQUITY UPLC Peptide CSH C18 VanGuard Pre-column, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 5 мм. В качестве подвижной фазы «A» использовалась деионизованная вода, подвижной фазы «В» – ацетонитрил. Обе фазы содержали в качестве модификатора 0,1% муравьиной кислоты. Элюирование производилось в градиенте подвижной фазы «В» при скорости потока 350 мкл/ мин: 0-3 мин – 2%, 3-13 мин градиент 2-95%; 13- 14,8 мин – 95% фазы «В», 14,8-15 мин – 2% фазы «В», после чего в течение 1 минуты возвращалась исходная концентрация фазы «B». Масс-спектры получали при разрешении 50 000 в диапазоне 50-1500 m/z, в режиме положительных ионов.

Детектирование пиков, их группировка и коррекция времени удерживания проводилась с помощью программного пакета MARS (Molecular Discovery Ltd, Великобритания). Для поиска и визуализации наибольших различий между группами сравнения использовали метод многомерной статистики – дискриминантный анализ ортогональных частичных наименьших квадратов (OPLS-DA) с помощью пакета программ платформы Metaboanalyst v6.0 (www.metaboanalyst.ca). В данной работе проводилось нетаргетное метаболомное исследование, поэтому полученные после предобработки данные также анализировались с помощью алгоритма mummichog на платформе сервисов MetaboAnalyst 6.0 для обогащения метаболических путей по молекулярным ионам, внесшим вклад в формирование отличий между группами сравнения. Даже при высокой точности определения массы, обеспечиваемой современными платформами масс-спектрометрии высокого разрешения, зачастую невозможно однозначно идентифицировать соединение, основываясь только на отношении его массы к заряду. Чтобы обойти эту проблему, ключевой концепцией является смещение анализа с отдельных соединений на пути или группу функционально родственных соединений, то есть наборов метаболитов. Общее предположение концепции состоит в том, что поведение группы более устойчиво к определенной степени случайных ошибок для отдельных компонентов. Алгоритм mummichog является первой реализацией этой концепции, позволяющей сделать вывод об активности путей по ранжированному списку пиков молекулярных ионов, идентифицированных с помощью нецелевой метаболомики, с учетом времен хроматографического разделения [5]. Оригинальный алгоритм реализует метод анализа перепредставленности для оценки обогащения на уровне путей на основе значимых признаков. Если набор признаков содержал соединения с несколькими вариантами идентификации, для каждого варианта идентификации создавались новые наборы переменных, каждый из которых содержал один из вариантов. В этом случае пути считались статистически значимыми, если p было меньше 0,1 для каждого набора соединений. Значения обогащения и вероятность наблюдения усреднялись по всем наборам, и вычислялось медианное значение количества соединений в каждом пути. Идентификация соединений проводилась по базам данных KEGG (www.genome.jp). В результате выполнения алгоритма по соответствующему набору данных формируется список обогащенных путей, включающий информацию об общем количестве известных метаболитов в пути, количестве идентифицированных метаболитов пути в данном наборе данных и значимости обогащения с использованием критерия Фишера.

Анализ экспрессии цитокинов TNF и IL-6 проводили методом ПЦР в реальном времени. Для выделения тотальной РНК, проведения обратной транскрипции и постановки ПЦР использовали коммерческие наборы компании Evrogen. Данные по кратности изменения экспрессии получали методом дельта-дельта Ct, с использованием в качестве референса ген HPRT.

Результаты и обсуждение

Инкубация клеток микроглии в условиях гипоксии в течение 1 часа с последующей реоксигенацией в течение 3 часов приводили к заметному усилению экспрессии TNF и IL-6 (рис. 1А). При нахождении в условиях гипоксии в течение 30 мин с последующей реоксигенацией 1 и 3 часа, изменений в экспрессии обоих цитокинов не наблюдалось (данные не приведены). Стимуляция LPS в течение 1 и 3 часов также приводила к повышению экспрессии TNF и IL-6 (рис. 1А). Полученные данные свидетельствуют об активации клеток микроглии под воздействием используемых стрессорных факторов. Временные интервалы активации клеток были учтены при профилировании метаболитов.

 

Рисунок 1. А – изменение экспрессии цитокинов TNF и IL-6 в клетках микроглии под действием гипоксии-реоксигенации и липополисахарида. Продолжительность гипоксии 1 ч, реоксигенации 1 и 3 ч соответственно. Время инкубации с LPS (100 нг/мл) 1 и 3 час соответственно. Б – оценка отличий профилей метаболитов в группах сравнения методом дискриминантного анализа ортогональных частичных наименьших квадратов (OPLS-DA). Группы сравнения: 1 – гипоксия 1 ч, реоксигенация 1 ч, 2 – гипоксия 1 ч, реоксигенация 3 ч; 3 и 4 – инкубация с липополисахаридом 1 и 3 часа соответственно; круги (ο) – образцы клеток после воздействия, треугольники (∆) – образцы клеток без воздействий

 

Далее проводили оценку изменения профилей метаболитов в клетках микроглии под воздействием гипоксии и LPS. Обработка данных ВЭЖХ-МС анализа клеточных экстрактов методом многомерной статистики (OPLS-DA) выявила четкую кластеризацию в группах сравнения (рис. 1Б). Данные свидетельствует о том, что гипоксическое воздействие и стимуляция LPS приводят к существенным изменениям в профилях метаболитов, в сравнении с интактными контролями. Далее полученные профили молекулярных ионов использовали для обогащения метаболических путей. Результаты обогащения по всем группам сравнения приведены в таблице 1. В таблице указаны названия обогащенных путей, общее количество метаболитов в пути, количество идентифицированных метаболитов и значение вероятности принятия нулевой гипотезы, полученное с использованием критерия Фишера. В условиях гипоксии продолжительностью 30 мин наиболее вероятные обогащения наблюдались по путям метаболизма глутатиона и арахидоновой кислоты. При часовой гипоксии и реоксигенации 1 час также обогащался путь метаболизма глутатиона, тогда как после трехчасовой реоксигенации обогащение наблюдается по путям метаболизма ряда аминокислот.

 

Таблица 1. Обогащение метаболических путей по данным профилирования метаболитов в клетках линии микроглии SIM-A9

Table 1. Enrichment of metabolic pathways according to metabolite profiling in SIM-A 9 cells

Метаболические пути Metabolic pathways	Количество метаболитов в пути Pathway total	Количество выявленных метаболитов Hits total	P (критерий Фишера) P (Fisher’s test)
Гипоксия 30 мин, реоксигенация 1 час Hypoxia 30 min, reoxygenation 1 h
Метаболизм пуринов Purine metabolism	71	9	0,077
Метаболизм глутатиона Glutathione metabolism	19	5	0,077
Метаболизм пиримидинов Pyrimidine metabolism	39	3	0,233
Гипоксия 30 мин, реоксигенация 3 часа Hypoxia 30 min, reoxygenation 3 h
Метаболизм глутатиона Glutathione metabolism	19	5	0,011
Метаболизм арахидоновой кислоты Arachidonic acid metabolism	42	13	0,045
Метаболизм глицина, серина, треонина Glycine, serine and threonine metabolism	31	6	0,098
Гипоксия 1 час, реоксигенация 1 час Hypoxia 1 h, reoxygenation 1 h
Метаболизм глутатиона Glutathione metabolism	19	5	0,043
Метаболизм аланина, аспартата, глутамата Alanine, aspartate and glutamate metabolism	28	2	0,083
Метаболизм тирозина Tyrosine metabolism	42	2	0,083
Гипоксия 1 час, реоксигенация 3 часа Hypoxia 1 h, reoxygenation 3 h
Метаболизм глутатиона Glutathione metabolism	19	6	0,000018
Метаболизм D-аминокислот D-Amino acid metabolism	15	8	0,000137
Метаболизм аргинина и пролина Arginine and proline metabolism	35	7	0,004
LPS 1 час LPS 1 h
Цикл трикарбоновых кислот Citrate cycle (TCA cycle)	16	7	0,002
Метаболизм бутаноата Butanoate metabolism	15	8	0,020
Метаболизм аланина, аспартата, глутамата Alanine, aspartate and glutamate metabolism	28	13	0,024
LPS 3 час LPS 3 h
Метаболизм триптофана Tryptophan metabolism	41	5	0,002
Метаболизм фенилаланина Phenylalanine metabolism	10	8	0,025
Метаболизм тирозина Tyrosine metabolism	42	12	0,044

 

В результате стимуляции клеток микроглии LPS в течение часа изменения профиля метаболитов привели к обогащению путей, связанных с циклом трикарбоновых кислот, метаболизма бутаноата и ряда аминокислот. После трехчасового воздействия LPS наблюдалось переключение обогащаемых путей на метаболизм аминокислот: триптофана, фенилаланина и тирозина.

Глутатион является эндогенным антиоксидантом, участвует в метаболизме арахидоновой кислоты, оказывает иммуномодулирующее действие, а также играет важную роль в поддержании гомеостаза нервной ткани [4]. Обогащение по пути метаболизма глутатиона, по-видимому, связано с развитием окислительного стресса в результате гипоксии-реоксигенации. Восстановленный глутатион совместно с ферментом глутатионпероксидазой являются важными компонентами антиоксидантной системы клетки, участвующей в нейтрализации активных форм кислорода, которые являются одним из факторов формирования провоспалительного фенотипа клеток микроглии [12]. Метаболизм аргинина играет важную роль в формировании реактивных форм микроглии, поскольку может быть субстратом для фермента аргиназы-1 и синтазы оксида азота, характерных для противо- и провоспалительных фенотипов микроглии соответственно [9]. Таким образом, изменение активности пути метаболизма глутатиона и аргинина может служить маркером поляризации клеток микроглии после гипоксического воздействия.

В условиях нормоксии, при короткой стимуляции (1 ч) TLR4 липополисахаридом, наблюдалось обогащение метаболических путей, свидетельствующее о значительных перестройках энергетического метаболизма. В частности, наблюдалось обогащение по путям превращений цикла трикарбоновых кислот. Ранее сообщалось, что TLR4 имеет решающее значение для активации микроглии и регуляции нейровоспаления. Его активация приводит к глюконеогенному репрограммированию и увеличению выработки лактата, ингибированию сукцинатдегидрогеназы и снижению активности цикла трикарбоновых кислот [7]. При более продолжительной стимуляции LPS наблюдалось изменение паттернов метаболических путей, с обогащением по путям метаболизма ароматических аминокислот. В частности, окислительный метаболизм триптофана может проходить по кинурининовому пути при участии фермента индоламиндеоксигеназы (IDO), экспрессия которого усиливается под действием LPS и провоспалительных цитокинов. Усиление активности IDO приводит к продукции активных форм кислорода, что также может способствовать снижению восстановленного глутатиона. Образование кинуренина и других метаболитов может оказывать иммуномодулирующее действие, однако дальнейшие превращения могут приводить к повышению продукции NAD⁺, необходимого для поддержания окислительно-восстановительного баланса клетки в условиях нейровоспаления [3].

Выводы

Повышение экспрессии провоспалительных цитокинов под действием гипоксии и липополисахарида свидетельствует об активации клеток линии микроглии SIM-A9.

Изменение активности путей метаболизма глутатиона и аргинина может служить маркером поляризации клеток микроглии после гипоксического воздействия.

Активация TLR4 под действием липополисахарида приводит к модулированию путей, ассоциированных с энергетическим обменом, а также изменению путей метаболизма ароматических аминокислот.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что провоспалительные стимулы приводят к заметным перестройкам метаболизма клеток микроглии. При этом характер данных перестроек зависит от типа стрессорного воздействия и его длительности. Можно заключить, что использованный в данной работе подход позволит в дальнейшем исследовать динамику метаболических изменений под действием провоспалительных факторов различной природы и детализировать их роль в метаболическом репрограммирования клеток микроглии на различных этапах развития нейровоспаления.

About the authors

Mikhail Yu. Bobrov

Sirius University of Science and Technologies

Author for correspondence.
Email: bobrov.my@talantiuspeh.ru

PhD (Сhemistry), Leading Researcher in the Field of “Immunobiology and biomedicine”, Scientific Center of Genetics and Life Sciences

Russian Federation, Sirius settlement, Krasnodar Region

V. S. Nikitin

Sirius University of Science and Technologies

Email: bobrov.my@talantiuspeh.ru

Laboratory Research Assistant, Master’s Student (Immunobiology and Biomedicine)

Russian Federation, Sirius settlement, Krasnodar Region

M. Yu. Burak

Sirius University of Science and Technologies

Email: bobrov.my@talantiuspeh.ru

Laboratory Research Assistant, Master’s Student (Immunobiology and Biomedicine)

Russian Federation, Sirius settlement, Krasnodar Region

M. B. Afonin

Sirius University of Science and Technologies

Email: bobrov.my@talantiuspeh.ru

Chief Research Engineer, Resource Center for Analytical Methods

Russian Federation, Sirius settlement, Krasnodar Region

References

Supplementary files