Immune status and expression of HLA-E, HLA-G and HLA-DR molecules on conventional T lymphocytes in patients with multiple myeloma before and after autologous hematopoietic stem cell transplantation

Full Text

Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Новосибирской области (соглашение № МЛ-1 от 26 октября 2023 г.).

Введение

HLA-G и HLA-E относятся к семейству Ib класса HLA, которое в отличие от молекул HLA-IA (HLA-A, HLA-B и HLA-C) является неклассическим и характеризуется ограниченным полиморфизмом и небольшим количеством аллелей. Неклассические молекулы HLA-I играют роль в контроле над эффекторными цитотоксическими клетками путем связи с ингибиторными рецепторами на их поверхности. Так, молекула HLA-G способна связываться с четырьмя ингибиторными рецепторами, экспрессируемыми иммунными клетками: ILT2 на NK-клетках, Т- и В-лимфоцитах; ILT4 на миелоидных клетках; KIR2DL4 на NK-клетках и Т-лимфоцитах; и CD160 на NK-клетках и Т-лимфоцитах. В свою очередь, молекула HLA-E способна связываться с ингибиторным рецептором NKG2A/CD94, к которому имеет сродство в шесть раз выше, чем к активирующему рецептору NKG2C/CD94 [9], влияя тем самым на активность NK- и Т-клеток, экспрессирующих эти рецепторы. В физиологических условиях молекулы HLA-G и HLA-E играют критическую роль в иммунной толерантности, опосредуя защиту полуаллогенного плода от материнских NK-клеток через взаимодействие с ингибиторными рецепторами (LILRB1, NKG2A/CD94). В трансплантологии мембраносвязанная форма HLA-G, взаимодействуя с рецептором KIR2DL4, индуцирует иммуносупрессивный фенотип дендритных клеток, снижая риск отторжения аллотрансплантата [10]. Однако при онкологических патологиях неклассические молекулы HLA Ib становятся инструментом уклонения трансформированных клеток от иммунного надзора: их экспрессия блокирует распознавание и уничтожение злокачественных клеток, способствуя прогрессии заболевания. Особую клиническую значимость представляет выявленный «HLA-G/E-ассоциированный фенотип» при раке молочной железы, характеризующийся 3,5-кратным повышением риска прогрессии (HR = 3,52; 95% ДИ 2,17-5,71) и резистентностью к PD-1-таргетной терапии, демонстрируя наихудший клинический исход [6]. Еще одним опухолевым заболеванием, в патогенезе которого играют роль нарушения иммунного баланса, связанные с экспрессией молекул HLA-G и HLA-E, является множественная миелома (ММ), которая характеризуется бесконтрольной пролиферацией в костном мозге клона предшественников В-лимфоцитов, которые сохраняют способность к дифференцировке до плазматических клеток и в большинстве случаев продуцируют патологический моноклональный иммуноглобулин или его фрагменты. Заболеваемость ММ насчитывает до 10-15% среди опухолей системы крови. Современные терапевтические подходы, включая применение ингибиторов протеасом (бортезомиб, карфилзомиб) и иммуномодулирующих препаратов (леналидомид, помалидомид), а также проведение высокодозной химиотерапии (ВХТ) с последующей трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК), позволили увеличить медиану общей выживаемости пациентов с ММ до 5-10 лет. Однако, несмотря на достижение ремиссии у большинства пациентов, прогрессирование заболевания остается неизбежным. ВХТ с последующей ауто-ТГСК остается ключевым терапевтическим подходом для пациентов с ММ, обеспечивая циторедукцию опухолевой массы за счет деплеции злокачественного клона, а также вызывая «иммунологическую перезагрузку» (immune reset) через индуцированную лимфопению, которая создает условия для периферической экспансии зрелых лимфоцитов [1]. Однако эффективность иммунологической перезагрузки при ауто-ТГСК может варьировать в зависимости от молекулярно-генетического профиля заболевания, особенно при наличии таких прогностически значимых аббераций, как транслокация t(4;14), ассоциированная с гиперэкспрессией гена MMSET (WHSC1) и FGFR3 [5], что усиливает пролиферацию и выживаемость опухолевых клонов, а также коррелирует с повышенной экспрессией молекулы HLA-E [13], что приводит к дисрегуляции взаимодействий между неопластическими плазматическими клетками и элементами костномозговой ниши, что способствует формированию иммуносупрессивного микроокружения [11]. В этом процессе ключевую роль играют молекулы HLA-E и HLA-G, которые поддерживают гипоксическое состояние через подавление VEGF-опосредованного ангиогенеза, создают порочный круг опухолевой персистенции за счет HIF-1α-зависимой регуляции своей экспрессии [7] и обеспечивают селективное преимущество злокачественных клонов через ингибирование цитотоксических NK-клеток, индукцию Treg-лимфоцитов путем трогоцитоза HLA-G с поверхности плазматических клеток, блокаду антиген-презентирующей функции [3]. В то время как неклассические молекулы HLA-G и HLA-E играют ключевую роль в иммуносупрессии через ингибирование врожденного иммунитета, классическая молекула HLA- DR (HLA класса II) выполняет принципиально иную функцию в патогенезе ММ. В отличие от иммуносупрессивных эффектов HLA-G/E, снижение экспрессии HLA-DR на антиген-презентирующих клетках приводит к нарушению презентации опухолевых антигенов, дефициту активации CD4⁺Т-хелперов, формированию иммунологически «холодного» микроокружения [2], когда увеличение экспрессии, наоборот, ассоциируется с усилением противоопухолевого иммунного ответа. Так, у пациентов с плоскоклеточным раком гортани высокая экспрессия HLA-DR на опухолевых клетках коррелировала со снижением частоты рецидивов и улучшением общей выживаемости, при этом микроокружение таких опухолей характеризовалось значительной инфильтрацией Т-лимфоцитов [8]. Несмотря на ключевую роль HLA-молекул в иммунном ответе при ММ, до настоящего времени отсутствовали комплексные исследования, оценивающие координированную экспрессию иммуносупрессивных (HLA-E, HLA-G) и иммунорегуляторных (HLA-DR) молекул на иммунокомпетентных клетках. Настоящая работа впервые предоставляет системный анализ этой триады HLA-маркеров, что в дальнейшем позволит раскрыть их взаимосвязь уклонения опухоли от иммунного надзора и клиническими исходами. Цель настоящей работы – определение изменений в соотношении субпопуляций лимфоцитов, в том числе экспрессирующих HLA-E, HLA-G и HLA-DR, а также основных популяций иммунокомпетентных клеток у пациентов с ММ после проведения высокодозной химиотерапии и аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Материалы и методы

В исследовании приняли участие пациенты с ММ (n = 10; средний возраст 62,2±2,7 года), которым в период с сентября 2024 г. по январь 2025 г. на базе ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» были выполнены ВХТ и ауто-ТГСК. Критерии включения лиц в исследование: пациенты мужского и женского пола с диагнозом «ММ» в возрасте от 18 до 65 лет, заболевание, которых соответствовало II или III клинической стадии по системе Durie–Salmon, а также наличие полной или очень хорошей частичной ремиссии на момент включения в исследование. Контрольную группу составили условно здоровые доноры (n = 8; средний возраст 44,6±4,7 года) после подписания добровольного информирования согласия. Критерии включения участников в контрольную группу: здоровые доноры мужского и женского пола в возрасте от 18 до 65 лет, не имеющие в анамнезе аутоиммунных заболеваний, онкологических патологий, а также хронических или рецидивирующих вирусных инфекций. Мобилизацию гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) у пациентов проводили с использованием циклофосфамида (2-4 г/ м²) с последующей инфузией гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (5 мкг/ кг/ день) в течение 4-5 дней до достижения концентрации CD34⁺CD45⁺ клеток в периферической крови (ПК) не менее 10⁴/ мл. Режим кондиционирования включал введение мелфалана в дозе 140-200 мг/м², адаптированной с учетом сопутствующих заболеваний. После ауто-ТГСК все пациенты получали поддерживающую терапию бортезомибом или леналидомидом. Забор образцов крови осуществляли после подписания информированного согласия. Оценку субпопуляций Т-лимфоцитов, экспрессирующих HLA-E, HLA-G и HLA-DR, а также NK-, NKT-клеток, В-лимфоцитов и моноцитов проводили в образцах периферической крови пациентов в два этапа: до начала кондиционирования (в среднем за 7 дней до ауто-ТГСК) и после процедуры в день выхода из лейкопении (лейкоциты > 1 × 10⁹/л, в среднем на 14-й день). Относительное содержание клеточных популяций (CD4⁺, CD4⁺HLA-E⁺, CD4⁺HLA-G⁺, CD4⁺HLA- DR⁺, CD8⁺, CD8⁺HLA-E⁺, CD8⁺HLA-G⁺, CD8⁺HLA- DR⁺, В-клетки, NK/ NKT-клетки, моноциты) анализировали методом проточной цитометрии с использованием панели моноклональных антител: анти-CD19 (APC), анти-CD4 (APC/ Cy7), анти-CD45 (PE/Cy7), анти-CD14 (PerCP), анти-CD3 (FITC) + анти-CD16/56 (PE), анти-CD8a (PE/ Cy7), анти-HLA-G (PE), анти-HLA-E (PerCP/Cy5,5), анти-HLA-DR (APC) (BioLegend, США). Клетки инкубировали с антителами в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут, после чего промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавлением 0,5% фетальной бычьей сыворотки (FCS, Hyclone, США). Данные регистрировали на проточном цитофлуориметре LongCyte™ (модель C3140, Challenbio, Китай) с последующим анализом в программе ModelFlower. Статистическую обработку выполняли в GraphPad Prism 10.4.1 (США) с применением критериев Манна–Уитни и Уилкоксона. Результаты представлены в виде медианы с интерквартильным размахом (25-75-й процентили). Уровень статистической значимости установлен при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Наши данные демонстрируют снижение пула Т-лимфоцитов, включая CD8⁺ и CD4⁺HLA-G⁺ субпопуляции (рис. 1А-В), у пациентов с ММ после ауто-ТГСК, что отражает кумулятивный иммуносупрессивный эффект высокодозной химиотерапии и кондиционирования мелфаланом. Особый интерес представляет деплеция CD4⁺HLA-G⁺ клеток (рис. 1В), которые формируют толерантную нишу для опухоли, являясь регуляторными клетка и в норме экспрессируя LILRB1/2 и TGF-β [14].

 

Рисунок 1. Относительное количество CD3⁺Т-лимфоцитов (А), CD8⁺Т-лимфоцитов (Б), CD4⁺HLA-G⁺Т-лимфоцитов (В) за 7 дней до аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК) и на 14-й день после ауто-ТГСК

Примечание. Критерий Уилкоксона, данные представлены в виде медианы с интерквартильным размахом – Me (Q_0,25-Q_0,75). * – статистически значимые различия (p < 0,05).

Figure 1. Relative number of CD3⁺T lymphocytes (A), CD8⁺T lymphocytes (B), CD4⁺HLA-G⁺T lymphocytes (C) 7 days before autologous hematopoietic stem cell transplantation (auto-HSCT) and on day 14 after auto-HSCT

Note. Wilcoxon test, data are presented as median with interquartile range – Me (Q_0.25-Q_0.75). *, statistically significant differences (p < 0.05).

 

Снижение их числа может отражать не только эффект терапии, но и свидетельствовать о нарушении механизмов HLA-G-опосредованного подавления противоопухолевого иммунного ответа [4]. Увеличение доли NK-клеток при одновременном снижении NKT-популяции (рис. 2А, Б) свидетельствует о переключении иммунного ответа на врожденные механизмы цитотоксичности, характерные для фенотипа «иммунного истощения» при ММ.

 

Рисунок 2. Относительное количество NK-клеток (А) и NKT-клеток (Б) у пациентов с множественной миеломой за 7 дней до ауто-ТГСК в сравнении с условно здоровыми донорами

Примечание. Критерий Манна–Уитни, данные представлены в виде Me (Q_0,25-Q_0,75), где П – пациенты, Д – доноры. * – статистически значимые различия (p < 0,05).

Figure 2. Relative number of NK cells (A) and NKT cells (B) in patients with multiple myeloma 7 days before auto-HSCT compared to conditionally healthy donors

Note. Mann–Whitney test, data are presented as Me (Q_0.25-Q_0.75), where P – patients, D – donors. *, statistically significant differences (p < 0.05).

 

При этом парадоксальное увеличение CD8⁺Т-клеток (рис. 3А), несмотря на общую лимфопению, может отражать клональную экспансию антиген-специфичных популяций с фенотипом exhausted T cells, что требует дальнейшего подтверждения. Примечательно, что полученные нами данные о преобладании CD8⁺Т-лимфоцитов у пациентов с ММ (рис. 3А) согласуются с современной концепцией хронической антиген-индуцированной Т-клеточной дисфункции [15].

 

Рисунок 3. Относительное количество CD8⁺T-лимфоцитов (А) и В-лимфоцитов (Б) у пациентов с множественной миеломой за 7 дней до ауто-ТГСК в сравнении с условно здоровыми донорами

Примечание. Критерий Манна–Уитни, данные представлены в виде Me (Q_0,25-Q_0,75), где П – пациенты, Д – доноры. p = 0,08 – критерий значимости на уровне тенденции.

Figure 3. Relative number of CD8⁺T lymphocytes (A) and B lymphocytes (B) in patients with multiple myeloma 7 days before auto-HSCT in comparison with conditionally healthy donors

Note. Mann–Whitney test, data are presented as Me (Q_0.25-Q_0.75), where P – patients, D – donors. p = 0.08, significance criterion at the trend level.

 

Также у пациентов наблюдается низкое количество В-лимфоцитов на уровне тенденции по сравнению с группой доноров (рис. 3Б).

Заключение

Дисрегуляция иммунного микроокружения при ММ обусловлена динамическим взаимодействием между опухолевыми клетками и компонентами иммунной системы, где молекулы HLA класса Ib (HLA-E, HLA-G) и класса II (HLA-DR) выступают ключевыми иммунорегуляторными элементами. Их дуалистическая роль – подавление эффекторных функций NK-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов с одной стороны, и потенцирование антиген-презентирующей способности дендритных клеток – с другой, подчеркивает сложность иммунного ответа при ММ. Детальная характеристика паттернов экспрессии этих молекул на различных субпопуляциях иммунокомпетентных клеток не только в периферической крови, но и в костномозговой нише может раскрыть новые аспекты иммуносупрессии и резистентности к терапии. Интеграция данных мультипараметрического проточного цитометрического анализа и транскриптомного анализа позволит не только идентифицировать прогностические биомаркеры, но и разработать персонализированные стратегии, направленные на восстановление иммунного надзора – включая, например, блокаду иммунных чекпоинтов и таргетное редактирование HLA-сигнальных путей.

About the authors

Ivan P. Skachkov

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology; Novosibirsk State Medical University

Email: pavania02@gmail.com
ORCID iD: 0009-0000-0530-3818

Student, Junior Researcher, Laboratory of Regulation of the Immune Response

Russian Federation, 14 Yadrintsevskaya St, Novosibirsk, 630099; Novosibirsk

Alina A. Aktanova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology; Novosibirsk State Medical University

Author for correspondence.
Email: aktanova_al@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2075-8551

Junior Researcher, Laboratory of Clinical Immunopathology, Assistant Professor, Department of Immunology, Faculty of Medicine

Russian Federation, 14 Yadrintsevskaya St, Novosibirsk, 630099; Novosibirsk

Vera V. Denisova

Novosibirsk State Medical University

Email: verden@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-1951-2260

PhD (Medicine), Head, Hematology Department with the Bone Marrow Transplantation, Clinic of Immunopathology

Russian Federation, Novosibirsk

Ekaterina A. Pashkina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology; Novosibirsk State Medical University

Email: pashkina.e.a@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4912-5512

PhD (Biology), Senior Researcher, Head, Laboratory of Immune Response Regulation, Associate Professor

Russian Federation, 14 Yadrintsevskaya St, Novosibirsk, 630099; Novosibirsk

References

Supplementary files