In vitro positive modification of effector functions and subsets of CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ and CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ neutrophil granulocytes from immunocompromised patients with immunosenescence induced by arginyl-α-aspartyl-lysyl-valyl-tyrosyl-arginine

Full Text

Введение

Неуклонное увеличение доли лиц пожилого и старческого возраста в человеческой популяции делает все более актуальной проблему профилактики, диагностики и лечения возраст-ассоциированных заболеваний и гериатрических синдромов, обусловливающих снижение качества жизни, способности к самообслуживанию и сокращение продолжительности жизни [7]. Известно, что одним из главных факторов, приводящих к старению и определяющих его характер, является возрастное изменение функционирования клеток и органов иммунной системы – иммуностарение. При этом оно может быть успешным (физиологическим) и характеризоваться высокой степенью адаптации иммунной системы к возраст-ассоциированным изменениям и патологическим, приводящим к возникновению вторичного иммунодефицита, который обусловливает развитие и утяжеляет течение возраст-ассоциированных заболеваний [3]. Одними из эффекторных клеток врожденного иммунитета являются нейтрофильные гранулоциты (НГ), претерпевающие значительные изменения в процессе старения. Так, известно, что с возрастом нарушаются эффекторные функции НГ [9]. Однако сведения о характере наблюдаемых изменений остаются противоречивыми и не позволяют судить о вариантах их дисфункций при иммуностарении. Кроме того, достаточно слабо изучен характер возможных фенотипических изменений НГ, ассоциированных с пожилым и старческим возрастом, что затрудняет поиск возможных точек приложения для фармакологического воздействия, направленного на коррекцию дисфункций НГ при иммуностарении. Именно поэтому является актуальным уточнение вариантов изменений функционирования НГ, связанных с иммуностарением, выявление потенциальных мишеней для иммунотерапевтического воздействия и исследование возможностей коррекции возникших дисфункций НГ в системе in vitro, что послужит экспериментальной моделью и обоснованием для последующих клинических исследований терапевтической эффективности иммунотропных лекарственных препаратов при иммуностарении.

В свете изложенного представляется перспективным ремоделирование дисфункций НГ при иммуностарении синтетическим тимическим гексапептидом аргинил-α-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинином (ГП), представляющим собой структурный аналог активного центра тимопоэтина. ГП оказывает плейотропное действие на различные клетки иммунной системы [1]. Подобно тимопоэтину, ГП взаимодействует с HLA-DR и никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами (nAChRs) нейронального типа на поверхности НГ, что модулирует их функциональную активность [10]. Кроме того, ГП обладает антиоксидантным эффектом [2], что является несомненным преимуществом для его применения у лиц пожилого и старческого возраста, так как известно, что одним из механизмов старения является оксидативный стресс [6].

Цель исследования – уточнить характер дисфункций НГ при иммуностарении и оценить эффект влияния синтетического тимического гексапептида на эффекторные функции и субпопуляции НГ CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ и CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ у лиц пожилого и старческого возраста.

Материалы и методы

В исследование были включены 15 иммунокомпрометированных пациентов в возрасте 60-78 лет с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) с затяжными и частыми обострениями – 2-3 раза в год (группа исследования 1, ГИ1), а также 30 условно здоровых добровольцев в возрасте 60-74 лет (группа сравнения, ГС). Проведено комплексное тестирование системы НГ периферической крови каждого исследуемого. Определялось процентное содержание субпопуляций НГ, одновременно экспрессирующих рецепторы CD64, CD32, CD16, CD11b, отвечающие за реализацию адгезии, фагоцитоза, дегрануляции: CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺, CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺. Плотность экспрессии изучаемых рецепторов оценивалась по значению среднего индекса флуоресценции (Mean fluorescence index, MFI).

Исследование фагоцитарной активности НГ включало в себя оценку процентного количества активно фагоцитирующих НГ (%ФАН), поглотительной способности НГ (фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ)), переваривающей способности НГ (процент переваривания (% П), индекс переваривания (ИП)).

NADPH-оксидазная активность НГ оценивалась путем подсчета клеток с восстановленным формазаном на 100 НГ в спонтанном и стимулированном (индукция лабораторным штаммом № 209 S. aureus) NBT-тесте (%ФПКсп, %ФПКст) и расчета коэффициента мобилизации (КМ), определяемого как отношение %ФПКст к %ФПКсп. Изучаемые параметры функционирования НГ в ГИ определялись в интактной крови – ГИ1, а также после инкубации в течение 60 минут при температуре 37 °C с ГП (10^-6 г/л) – ГИ1а.

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью компьютерной программы Microsoft Excel 2016 и свободной программной среды вычислений R (v. 4.2.2). Количественные показатели проверялись на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро–Уилка. Так как исследуемые данные не были нормально распределены, они представлены в виде медианы с верхним и нижним квартилями (Me (Q_0,25-Q_0,75)), а для сравнения количественных показателей в исследуемых выборочных совокупностях были использованы методы непараметрической статистики: U-критерий Манна–Уитни для сравнения независимых выборок и W-критерий Вилкоксона для сравнения зависимых выборок. Для корректировки значения p с учетом множественных сравнений был применен контроль частоты ложных обнаружений по процедуре Бенджамини–Иекутиели. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Кроме того, была оценена величина эффекта с помощью вычисления коэффициента ранговой бисериальной корреляции для связанных выборок. При его значении, равном 0, констатировалось отсутствие эффекта, при значениях 0,1-0,3 величина эффекта оценивалась как низкая, 0,31-0,5 – как средняя, более 0,5 – как высокая.

Результаты и обсуждение

В результате изучения экспрессии рецепторов CD64, CD32, CD16, CD11b на НГ были выявлены две субпопуляции НГ: CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ и CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b^{+ (рис. 1)}. Содержание субпопуляции CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺НГ – мажорной, так как количество именно этой субпопуляции преобладает в ГС (94,34 (89,61- 95,95)%), в ГИ1 составляет 81 (62,81- 88,75)%, что статистически значимо ниже (p = 0,0059), чем в ГС. Содержание субпопуляции CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺НГ – минорной, присутствующей в минимальных количествах в ГС (1,15 (0,65-3,1)%), в ГИ1 было статистически значимо выше, чем в ГС – 10 (5,8- 31,3)% (p = 0,0012). Данные изменения соотношения субпопуляций НГ указывают на активацию НГ в условиях бактериальной инфекции. При этом характерна более высокая плотность экспрессии CD16 как в мажорной субпопуляции НГ (74,1 (58,25-79,25) против 33,6 (9,97-45,4) в ГС, p = 0,006), так и в минорной субпопуляции НГ (91,6 (68,25-98,45) против 28,4 (13,7-65,44) в ГС, p = 0,0048). С одной стороны, это свидетельствует о повышенной цитотоксической активности НГ [4], что может служить компенсаторным изменением в ответ на сниженную фагоцитарную функцию, а с другой стороны, плотность экспрессии CD16 положительно коррелирует со степенью зрелости НГ, и ее повышение в совокупности со снижением плотности экспрессии CD62L указывает на старение НГ [8].

 

Рисунок 1. Процентное содержание и фенотипические характеристики CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺НГ (А) и CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺НГ (Б)

Figure 1. Percentage and phenotypic characteristics of CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺NG (A) and CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺NG (B)

 

Кроме того, в ГИ1 отмечается более низкая плотность экспрессии CD11b в обеих субпопуляциях НГ: в мажорной субпопуляции – 12,6 (10,8- 14,78) против 32,3 (23,55-38,85) в ГС (p = 0,0019), в минорной субпопуляции – 15,3 (13,15-16,55) против 31,1 (23,95-42,1) в ГС (p = 0,0004), что свидетельствует о нарушении способности НГ к хемотаксису, миграции, адгезии, а при совместной работе с другими рецепторами к фагоцитозу и антителозависимой клеточной цитотоксичности, что в совокупности приводит к дисрегуляции функциональной активности НГ [5].

Показатели фагоцитарной активности НГ пациентов ГИ1 также демонстрируют значительные изменения по сравнению с ГС (рис. 2). Так, выявлено статистически значимое снижение %ФАН (49 (38-58) %, p = 0,006), ФЧ (3,19 (2,28-3,43), p = 0,0025), ФИ (1,26 (0,96-2,05), p = 0,0002), %П (34 (24,59-44,67) %, p = 0,0029) и ИП (0,45 (0,4- 0,6), p = 0,0009) у пациентов ГИ1 относительно ГС (65 (62-79,5) %; 6,3 (4,5-6,7); 4,026 (3,538-4,241); 58 (51,5-63) %; 2,28 (2,02-2,45) соответственно), что свидетельствует о нарушении как поглотительной, так и переваривающей способности НГ в ГИ1.

 

Рисунок 2. Показатели фагоцитарной и микробицидной эффекторных функций НГ в ГИ1, ГИ1а и ГС

Figure 2. Indicators of phagocytic and microbicidal effector functions of NG in SG1, SG1a and CG

 

При этом показатели NADPH-оксидазной активности НГ в ГИ1 соответствуют уровню, отмечаемому в ГС. Так, %ФПКсп в ГИ1 (3 (1-8) %) по сравнению с ГС (3 (2-3,25) % статистически значимо не отличался (p = 1,00), в отношении %ФПКст была отмечена статистически незначимая (p = 0,397) тенденция к повышению в ГИ1 (10 (4-42) %) по сравнению с ГС (5 (2,75-6) %), коэффициент мобилизации в ГИ1 (2,94 (1,25- 4,33)) также статистически значимо не отличался (p = 0,5516) от показателя ГС (1,55 (1,3-1,925)), что, учитывая наличие признаков бактериальной инфекции, говорит о неадекватном ответе микробицидных систем НГ и нарушении продукции активных форм кислорода, отсутствии резервного мобилизационного потенциала.

После инкубации с ГП процентное содержание мажорной субпопуляции НГ в ГИ1а повысилось (p = 0,0492, r_rb = 0,73 (95% ДИ: 0,42-1,00)) и составило 93,56 (81,19-95,00) %, статистически значимо не отличаясь от показателя ГС (p = 0,756). Процентное содержание минорной субпопуляции НГ после инкубации снизилось с высокой величиной эффекта (r_rb = 0,63 (95% ДИ: 0,26- 1,00), p = 0,1198) и соответствовало уровню ГС (p = 0,066), что указывает на позитивный эффект в виде изменения соотношения субпопуляций НГ под действием ГП в сторону преобладания мажорной субпопуляции НГ, как и в ГС.

Кроме того, в ГИ1а отмечалась высокая величина эффекта – повышение плотности экспрессии CD11b на НГ субпопуляции CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ (14,78 (12,62-17,16), p = 0,2273, r_rb = 0,6 (95% ДИ: 0,21-1,00)) и субпопуляции CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺НГ (18,1 (11,49-19,11), p = 0,3408, r_rb = 0,56 (95% ДИ: 0,15-1,00)), которое, однако, не достигло уровней ГС.

Также выявлено статистически незначимое снижение MFI CD16 в ГИ1а со средней величиной эффекта как на НГ субпопуляции CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ (69,50 (56,50-75,95), p = 0,7841, r_rb = 0,33 (95% ДИ: -0,14-1,00)), так и на НГ субпопуляции CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ (82,80 (65,75-90,55), p = 0,614, r_rb = 0,38 (95% ДИ: -0,08-1,00)).

Важно отметить, что инкубация с ГП способствовала частичному восстановлению фагоцитарной функции НГ, о чем свидетельствует статистически значимое выраженное повышение переваривающей способности НГ: %П (60 (56,95- 64,24) %, p = 0,0049, r_rb = 0,96 (95% ДИ: 0,88-1,00)) и ИП (0,96 (0,8-1,29), p = 0,004, r_rb = 0,98 (95% ДИ: 0,94-1,00)). При этом повышение %ФАН (50 (47- 65) %, p = 0,6366, r_rb = 0,4 (95% ДИ: -0,1-1,00)) имело среднюю степень выраженности эффекта, а повышение ФЧ (3,39 (2,65- 4,26), p = 1,00, r_rb = 0,25 (95% ДИ: 0,25- 1,00)) и ФИ (1,51 (1,35-2,59), p = 1,00, r_rb = 0,25 (95% ДИ: -0,25-1,00)) имело низкую величину и не являлось статистически значимым, что может быть обусловлено сохраняющимся нарушением процессов захвата бактериального антигена у пациентов ГИ1а.

Инкубация с ГП не привела к существенным изменениям NADPH-оксидазной активности НГ в спонтанном NBT-тесте, на что указывает отсутствие статистически значимых различий между %ФПКсп в ГИ1 до (3 (1-8) %) и после инкубации (8 (1-10) %, p = 1,00, r_rb = 0,22 (95% ДИ: 0,28-1,00)). Однако под влиянием ГП NADPH-оксидазная активность НГ в ответ на стимуляцию улучшилась, о чем говорит высокая величина повышения %ФПКст в ГИ1а (19 (12-58) %, p = 0,4817, r_rb = 0,5 (95% ДИ: 0,03-1,00)) и наметилась тенденция к восстановлению резервного микробицидного потенциала.

Заключение

Таким образом, у иммунокомпрометированных пациентов пожилого и старческого возраста с ХОБЛ выявлено изменение соотношения субпопуляций НГ, выражающееся в увеличении доли минорной субпопуляции CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺НГ, свидетельствующей о наличии бактериальной инфекции и неблагоприятном течении ХОБЛ с частым рецидивированием и затяжным течением вследствие отсутствия своевременного клиренса бактериальных антигенов и поддержания воспалительного процесса. Фенотипические изменения субпопуляций НГ CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ и CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ ассоциированы с повышением плотности экспрессии CD16 – рецептора, увеличение экспрессии которого может свидетельствовать об активации клеток и в то же время быть признаком зрелости НГ, а также снижением плотности экспрессии CD11b. Перераспределение экспрессии поверхностных мембранных рецепторов на НГ существенно влияет на функциональный эффекторный потенциал НГ, снижая фагоцитарную и микробицидную функции у пациентов с ХОБЛ. При оценке величины эффекта влияния ГП в системе in vitro на НГ отмечалась высокая величина эффекта – повышение содержания мажорной субпопуляции НГ и снижение содержания минорной субпопуляции НГ, повышение плотности экспрессии CD11b на НГ обеих субпопуляций, повышение переваривающей активности НГ (%П, ИП), повышение NADPH-оксидазной активности НГ в ответ на стимуляцию, средняя величина эффекта – снижение плотности экспрессии CD16 и повышение количества активно фагоцитирующих НГ, низкая величина эффекта выявлена в отношении параметров, характеризующих процессы захвата при фагоцитарной реакции, а также спонтанной NADPH-оксидазной активности НГ. Исследованиями продемонстрирована позитивная модификация функционирования НГ под влиянием ГП в эксперименте in vitro, сопровождающаяся восстановлением соотношения субпопуляций CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺НГ и CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺НГ и ремоделированием их фенотипа на фоне улучшения эффекторных функций НГ, что позиционирует возможность использования ГП для направленной коррекции дисфункций НГ при иммуностарении и дальнейшие перспективы для проведения клинических исследований по применению фармпрепарата ГП у иммунокомпрометированных пациентов пожилого и старческого возраста.

About the authors

Svetlana V. Kovaleva

Kuban State Medical University

Author for correspondence.
Email: 3483335@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9604-5806

PhD, MD (Medicine), Senior Researcher of the Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Research Laboratory,Professor of the Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics

Russian Federation, 4 Mitrofan Sedin St, Krasnodar, 350063

Elisey A. Poezzhaev

Kuban State Medical University

Email: epoezzhaev.ep@gmail.com
ORCID iD: 0009-0009-9203-6847

Postgraduate Student, Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics

Russian Federation, 4 Mitrofan Sedin St, Krasnodar, 350063

Yuriy V. Teterin

Kuban State Medical University

Email: yura.teterin.1989@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3073-5070

Assistant Professor, Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics

Russian Federation, 4 Mitrofan Sedin St, Krasnodar, 350063

Svetlana N. Pikturno

Kuban State Medical University

Email: spikturno@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9376-3397

Assistant Professor, Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics

Russian Federation, 4 Mitrofan Sedin St, Krasnodar, 350063

References

Supplementary files