Laboratory criteria for improving the diagnosis of autoimmune hepatitis and Wilson’s disease in children

Anastasia A. Zhuzhula; Жужула Анастасия Андреевна; Olga V. Kurbatova; Курбатова Ольга Владимировна; Svetlana V. Petrichuk; Петричук Светлана Валентиновна; Andrei P. Fisenko; Фисенко Андрей Петрович; Marina A. Snovskaya; Сновская Марина Андреевна; Goar B. Movsisyan; Мовсисян Гоар Борисовна; Alexander S. Potapov; Потапов Александр Сергеевич; Elena L. Semikina; Семикина Елена Леонидовна

doi:10.46235/1028-7221-17275-LCF

Laboratory criteria for improving the diagnosis of autoimmune hepatitis and Wilson’s disease in children

Authors: Zhuzhula A.A.¹, Kurbatova O.V.¹, Petrichuk S.V.¹, Fisenko A.P.¹, Snovskaya M.A.¹, Movsisyan G.B.¹, Potapov A.S.¹^,2, Semikina E.L.¹^,2
Affiliations:
1. National Medical Research Center for Children’s Health
2. I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)
Issue: Vol 28, No 4 (2025)
Pages: 971-978
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 15.05.2025
Accepted: 22.06.2025
Published: 28.09.2025
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/17275
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-17275-LCF
ID: 17275

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Specification of laboratory criteria for improving differential diagnostics of children with autoimmune hepatitis (AIH) and Wilson’s disease (WD) is a relevant task in pediatrics. Increased titers of antinuclear factor (ANF) in blood serum is among laboratory criteria for diagnostics of AIH. Some WD cases have been described which can manifest as autoimmune hepatitis (AIH) with detection of non-specific autoantibodies, thus complicating the differential diagnosis. The aim of our study was to identify the specific features for determination of antinuclear factor on the Hep-2 cell line and specific autoantibodies using a triple cell substrate in children with autoimmune hepatitis and WD. We have examined 62 pediatric patients with WD and 28 children with AIH. ANF was determined on the HEp-2 cell line (ANA-HEp-2, AESKUSLIDES^®, Germany). Specific auto-antibodies were detected by means of a triple substrate obtained from rodents, which included samples of kidney, liver and stomach tissues (LKS Mouse, Germany) using indirect fluorescence reactions applying an automated analyzer HELIOS^® (Germany). The analysis revealed ANF positivity in 15 out of 62 (24%) children with WD. Positive ANF results were obtained in 26 out of 28 children AIH (93%), being significantly more common in AIH compared with WD. The study of specific autoantibodies using a triple substrate revealed positive results in 34 children with WD (55%), versus 26 children with AIH (93%), Hence, the specific auto-antibodies on the triple substrate are more commonly found in children with AIH (p < 0.001) than in children with WD. In children with suspected AIH, when a homogeneous type of luminescence is detected on the HEp-2 cell line, and with a combination of different luminescence types on a triple substrate, the presence of Wilson’s disease in patients cannot be excluded.

Keywords

children, autoimmune hepatitis, Wilson’s disease, antinuclear factor, Hep-2 cell line, triple LKS murine substrate, autoantibodies to microsomes, LKM-1 antibodies, liver, kidneys, smooth muscle antibodies, mitochondrial autoantibodies, gastric parietal cell autoantibodies

Full Text

Введение

Заболевания печени – группа наследственных и приобретенных заболеваний с разнообразной клинической картиной [9]. К одним из распространенных заболеваний печени у детей относят аутоиммунный гепатит (АИГ), болезнь Вильсона–Коновалова и другие.

Болезнь Вильсона (БВ) – тяжелое редкое наследственное заболевание, характеризующееся нарушением метаболизма меди и избыточным накоплением меди в различных органах и тканях, что приводит к сочетанному поражению преимущественно паренхиматозных органов (печень) и центральной нервной системы (в чечевиднообразных ядрах, в подкорковых ядрах и в коре головного мозга) [4, 9, 10]. Распространенность БВ колеблется от 1:30 000 до 1:100 000 человек [8, 10]. Чаще болезнь встречается у мужчин, чем у женщин [10].

БВ вызвана мутацией в гене АТР7В, который кодирует трансмембранную АТФазу, транспортирующую медь, из-за чего избыточно накапливается медь в гепатоцитах, разрушая их и повышая концентрацию свободной меди в сыворотке крови и увеличенной экскреции меди с мочой [4, 9, 10, 11].

БВ у детей отличается широким полиморфизмом клинической симптоматики: дебют заболевания начинается с поражением печени в 5-18 лет (40-45% случаев), в 30% случаев – с развитием неврологических и психических расстройств [4, 9]. БВ является трудно диагностируемым заболеванием печени из-за длительного латентного течения, особенно на начальных этапах заболевания [8]. Поэтому актуальным является изучение пациентов детского возраста с патологией печени неуточненной этиологии для подтверждения/исключения БВ [8].

Описаны случаи, когда БВ может клинически протекать по типу АИГ с выявлением неспецифических аутоантител, что затрудняет дифференциальную диагностику, при этом не исключает аутоиммунный компонент в патогенезе БВ [4]. Описаны случаи обнаружения антител к микросомам печени и почек 1-го типа (LKM- 1) у пациентов с БВ после эпизодов отторжения трансплантатов печени [7]. Тем не менее частота выявления наличия специфических аутоантител при БВ не изучена, поэтому следует проявлять настороженность при дифференциальной диагностике печеночной формы БВ и АИГ [13].

АИГ – тяжелое хроническое аутоиммунное воспалительное заболевание печени неизвестной этиологии, характеризующееся продукцией аутоантител к собственным гепатоцитам [1, 3, 7, 14]. АИГ является редким заболеванием, его распространенность в Европе и США колеблется 3-17 случаев на 100 000 человек [3]. В России в структуре хронических гепатитов у детей доля АИГ составляет 2%, лица женского пола болеют чаще [1].

В развитии АИГ одной из основных причин является нарушение иммунотолерантности организма у генетически предрасположенных лиц [1, 3]. Нарушения в иммунной системе могут проявляться дефектом функции регуляторных Т-клеток и наличием аутоантител в крови [1, 3]. Аутоантитела фиксируются на мембране гепатоцитов, способствуя их разрушению собственными лимфоцитами [1, 3].

Одним из критериев постановки диагноза АИГ является повышение титров антинуклеарного фактора (АНФ) в сыворотке крови [1]. У детей в зависимости от выявленных аутоантител выделяют 2 типа АИГ: АИГ 1-го типа, при котором выявляются специфические аутоантитела к гладкой мускулатуре (ASMA) и/или АНФ и АИГ 2-го типа, при котором выявляются специфические антитела к микросомам печени и почек 1-го типа (LKM-1), и/или антитела к цитозольному антигену печени 1-го типа (LC-1) [1, 3, 7]. АИГ 2-го типа составляет 3-4% от всех случаев АИГ [1, 3]. Антитела к печеночному растворимому антигену (SLA) – аутоантитела, которые специфичны и обладают высокой диагностической значимостью при любом типе АИГ [1].

Определение лабораторных критериев для совершенствования дифференциальной диагностики детей с АИГ и БВ является актуальным в педиатрии.

Цель исследования – выявить особенности определения АНФ на клеточной линии Hep-2 и специфических аутоантител с использованием тройного субстрата у детей с АИГ и БВ.

Материалы и методы

В исследование было включено 62 ребенка с БВ и 28 детей с АИГ, находившиеся на обследовании в гастроэнтерологическом отделении в ФГАУ «НМИЦ здоровья детей» Минздрава России.

Всем детям определяли АНФ на клеточной линии HEp-2 (клетки аденокарциномы гортани человека) с помощью реакции непрямой флюоресценции (РНИФ, AESKUSLIDES^® ANA-HEp-2, Германия) с использованием автоматического анализатора HELIOS^® (AESKU.GROUP, Германия) [2]. Данное исследование является «золотым стандартом» лабораторной диагностики выявления аутоантител в сыворотке крови [2, 3, 4]. Результат анализа представляет собой информацию о конечной титре и типе свечения ядра и цитоплазмы клеток HEp-2 [3]. Отрицательными значениями считали титры АНФ < 1/160, при титре 1/160 ответ считали низкопозитивным, 1/320-1/640 – умеренно позитивным, 1/1280 и выше – высокопозитивным [3]. Любой из выявленных типов свечений АНФ мы принимали за положительный результат [3].

Всем детям определяли специфические аутоантитела с использованием тройного субстрата, полученного от грызунов, который включает образцы тканей почки, печени и желудка (AESKUSLIDES^® LKS Mouse, separated, Германия). Метод основан на РНИФ и позволяет выявить аутоантитела к микросомам печени и почек 1-го типа (LKM-1), к гладким мышцам (ASMA), к митохондриям (AMA), к париетальным клеткам желудка (PCA) [3]. Примеры типов свечения для выявление аутоантител с использованием тройного субстрата представлены на рисунке 1 (см. 3-ю стр. обложки).

Рисунок 1. А1, 2 – аутоантитела к гладким мышцам (ASMA), Б – к митохондриям (AMA), Б1 – к париетальным клеткам желудка (PCA), В – аутоантитела к микросомам печени и почек 1-го типа (LKM-1)

Figure 1. A1, 2, autoantibodies to smooth muscles (ASMA); B, to mitochondria (AMA); B1, to parietal cells of the stomach (PCA); C, autoantibodies to liver and kidney microsomes type 1 (LKM-1)

Статистическая обработка проводилась в программе Microsoft Exсel 2010 с расчетом ошибки среднего для доли варианта и достоверности по t-критерию.

Результаты и обсуждение

Проведенный анализ выявил положительные результаты исследования АНФ у 15 детей из 62 (24%) с БВ. Из них у 10 детей был низкопозитивный титр (1/160 – 16%), у 4 детей – умеренно позитивный титр (1/320-640 – 6%), у 1 ребенка – высокопозитивный титр (1/2560 – 2%). Положительные результаты АНФ получены у 26 детей из 28 (93%) с АИГ. Из них у 5 детей был низкопозитивный титр (18%), у 10 детей – умеренно позитивный титр (36%), у 11 детей – высокопозитивный титр (1/1280-5120 – 39%). Таким образом, получено, что достоверно чаще АНФ выявляется у детей с АИГ по сравнению с БВ (р < 0,001; табл. 1).

Таблица 1. Сравнительная характеристика типов свечения у детей при БВ и АИГ

Table 1. Comparative characteristics of the types of luminescence in children with WD and AIH

Типы свечения Types of glow	БВ (n, %) WD (n, %)	АИГ (n, %) AIH (n, %)	Достоверные различия, р Significant difference, р
АНФ на клеточной линии HEp-2 ANF on the HEp-2 cell line
Гомогенный (h) Homogeneous	5; 33% ±5,9	3; 12% ±6,1	р < 0,02
Гранулярный (sp) Speckled	4; 27% ±5,6	3; 12% ±6,1	–
Цитоплазматический (cytopl) Cytoplasmic	1; 6,5% ±3,1	–	–
Центромерный (centr) Centromere	1; 6,5% ±3,1	–	–
Смешанный Mixed: – h + cytopl – h + sp + cytopl – nucl + cytopl – sp + cytopl – h + sp	4; 27% ±5,6 2; 13% ±4,3 1; 7% ±3,2 1; 7% ±3,2 – –	20; 76% ±8 16; 62% ±9,2 1; 3,5% ±3,5 – 2; 7% ±4,8 1; 3,5% ±3,5	р < 0,001
Всего Total	15; 24% ±5,4	26; 93% ±4,8	р < 0,001
Определение специфических аутоантител на тройном субстрате Determination of specific autoantibodies on a triple substrate
ASMA	6; 18% ±4,9	14; 54% ±9,4	р < 0,001
AMA	14; 41% ±6,2	6; 23% ±8	–
LKM-1	–	3; 12% ±6,1	–
PCA	1; 3% ±2,2	1; 4% ±3,7	–
Смешанный Mixed: – AMA + ASMA – AMA + PCA – ASMA + PCA – LKM-1 + PCA – ASMA + LKM-1	13; 38% ±6,1 9; 26% ±5,6 2; 6% ±3 1; 3% ±2,2 1; 3% ±2,2 –	2; 7% ±4,8 – – – – 2; 7% ±4,8	р < 0,001
Всего Total	34; 55% ±6,32	26; 93% ±4,8	р < 0,001

Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что титры свечения АНФ выше при АИГ, чем при БВ, согласуются с данными литературы [3, 4]. Сообщения о выявлении аутоантител при БВ у детей, представленые клиническими случаями, подтверждаются нашими данными, полученными на большой выборке [4, 9].

При анализе типов свечения АНФ у детей с БВ чаще встречались: гомогенный (33%), гранулярный (27%) и комбинации типов свечения, преимущественно гомогенного и цитоплазматического (13%) (табл. 1). У детей с АИГ чаще встречались комбинации типов свечения, преимущественно гомогенного и цитоплазматического (62%), тогда как гомогенный и гранулярный типы свечения выявлялись в 12% случаев каждый.

Сравнительный анализ типов свечения АНФ у детей с БВ и АИГ показал, что при БВ достоверно чаще встречаются гомогенный (р < 0,02) тип свечения. Однако различные комбинации типов свечения достоверно чаще встречаются при АИГ (р < 0,001).

Сопоставление полученных данных о преобладающих типах свечения АНФ у детей при БВ частично согласуется с данными литературы о выявлении преимущественно гранулярного типа свечения, а также гомогенного и комбинации гомогенного и цитоплазматического типов свечения [4].

При исследовании специфических аутоантител с использованием тройного субстрата были выявлены положительные результаты у 34 детей с БВ (55%) и у 26 детей с АИГ (93%). У детей с БВ чаще выявлялись антитела к AMA в 41%, к ASMA в 18%, а также к комбинациям типам свечения, преимущественно к AMA и ASMA – 26%. У детей с АИГ чаще выявлялись антитела к ASMA – 54%, к AMA – 23%, к LKM-1 – 12%. Анализ данных показал, что достоверно чаще специфические аутоантитела на тройном субстрате выявляются у детей с АИГ (р < 0,001), чем у детей с БВ.

Сравнительный анализ типов свечения специфических аутоантител на тройном субстрате у детей с БВ и АИГ показал, что при БВ достоверно чаще выявляются комбинации разных типов свечения специфических аутоантител (р < 0,001), а при АИГ достоверно чаще встречаются антитела к ASMA (р < 0,001).

Аутоантитела у детей с БВ выявляются в 55% случаев, хотя для них характерны менее низкопозитивные титры свечения, как на клеточной линии HEp-2, так и на тройном субстрате. Аутоантитела у детей с БВ чаще выявляются на тройном субстрате, чем на линии HEp-2, в связи с тем, что учитываются более низкие титры свечения образца, включая титры 1/20.

Полученные результаты выявления аутоантител у детей с АИГ и БВ согласуются с данными литературы о повышении содержания провоспалительных Тh17-лимфоцитов, что характерно для аутоиммунных заболеваний [4, 5].

В настоящий момент продолжается поиск дополнительных специфических маркеров для лабораторной диагностики АИГ и других заболеваний печени. Потенциальным маркером может являться полиреактивный IgG [12].

Заключение

Таким образом, при обследовании ребенка с подозрением на АИГ при выявлении гомогенного типа свечения на клеточной линии HEp-2 и при комбинации различных типов свечения на тройном субстрате нельзя исключать наличие у пациентов БВ.

About the authors