Reconstructive immunomodulation under the influence of thymic hexapeptide of number and phenotype of subsets CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- and CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ of neutrophilic granulocytes in children with acute destructive pneumonia, is associated with positive clinical efficacy

Full Text

Работа выполнена в рамках государственного задания (проект тематик научных исследований № 1024021500107-5 от 15.02.2024).

Введение

В настоящее время результаты многочисленных исследований, составляют большую базу новых убедительных данных, подтверждающих важную роль мультивариантных дефектов, функционирующих нейтрофильных гранулоцитов (НГ) в иммунопатогенезе нетипично протекающих инфекционно-воспалительных, в том числе гнойно-воспалительных заболеваний (ГВЗ) [1]. НГ проявляют мощные антимикробные функции, включая фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода, формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET). Признано, что НГ являются транскрипционно активными сложными клетками, которые продуцируют цитокины, модулируют активность других соседних клеток и способствуют разрешению воспаления [5, 11]. Множество функциональных реакций НГ индуцируется активацией транскрипции и изменениями плотности экспрессии поверхностных молекул, в частности CD11b, CD16, CD32, CD64, CD62L-молекул и повышением или снижением активности [9, 14].

Современные методы проточной цитометрии позволяют оценить плотность экспрессии поверхностных мембранных рецепторов, зарегистрировать поляризацию фенотипа в определенную субпопуляцию НГ в ответ на индуцирующие сигналы при ГВЗ и определить взаимосвязь с эффекторным функциональным потенциалом НГ [5]. Различные субпопуляции НГ способны оказывать как позитивное влияние на течение инфекционно-воспалительного процесса – способствовать его регрессии, так и обладать негативным супрессирующим влиянием на иммунную систему (ИС), что приводит к утяжелению гнойно-воспалительных процессов или к возникновению рецидивирующих нетипично протекающих ГВЗ, не поддающихся традиционному лечению, предусмотренному клиническими рекомендациями [6, 13].

Внебольничная пневмония является одной из ведущих тяжелых инфекций у детей, особенно среди детей в возрасте до пяти лет, вызывая в глобальном масштабе 14% летальных исходов в этой возрастной группе [12]. Легочные, легочно-плевральные и системные осложнения развиваются у 7-10% заболевших [7]. Острая деструктивная пневмония (ОДП) – наиболее тяжелое заболеваний у детей, характеризуется некрозом с последующим гнойным расплавлением легочной ткани. Основными возбудителями, ассоциированными с деструкцией легких у детей, считаются S. pneumoniae, S. aureus, нередко MRSA [2, 7]. Несмотря на совершенствование методов диагностики и возможности использования антибиотиков широкого спектра действия на старте терапии и различных хирургических пособий, частота гнойно-деструктивных осложнений остается высокой [2].

Дефекты функционирования иммунной систем (ИС) и, в первую очередь, НГ являются неоспоримым фактором развития, тяжести течения, распространенности гнойно-воспалительного процесса [6]. Оперативные вмешательства, стресс, воздействие высокоинтенсивной антибиотикотерапии у детей с ОДП, в свою очередь, приводят к усугублению имеющихся дисфункций ИС и иммунопатологических состояний [3, 8].

Несмотря на значительный опыт как отечественных, так и зарубежных исследователей в применении различных методов лечения ОДП, на сегодняшний день отсутствует единый консенсус по ведению детей с этим заболеванием. Особая актуальность принадлежит методологии междисциплинарного, патогенетически обоснованного подхода в комплексной терапии, соединяющий хирургические и консервативные методы лечения, направленные на устранение инфекционного агента, удаление токсических веществ, купированию дыхательных нарушений, а также восстановлению нормального функционирования ИС. Перспективным направлением в решении этих задач является внедрение иммунокорригирующей терапии в комплекс лечебных мероприятий [8].

Цель исследования – на базе уточнения особенностей дефектного функционирования НГ, связанных с изменением соотношения и фенотипа субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ детей с острыми деструктивными пневмониями, оценить клинико-иммунологическую эффективность применения в комплексном послеоперационном лечении иммуномодулирующей терапии с использованием фармпрепарата, действующей субстанцией которого является синтетический тимический гексапептид.

Материалы и методы

В группу исследования вошли дети 2-4 лет: с диагнозом ОДП (n = 21, 11 мальчиков и 10 девочек) – группа исследования (ГИ), 20 условно здоровых детей (10 мальчиков и 10 девочек) – группа сравнения (ГС). «Критерии включения в ГИ: клинические признаки вторичного иммунодефицита (острые респираторные вирусные инфекции более 10 раз в год, длительностью более 2 недель, которые часто осложнялись присоединением острой или обострением хронической бактериальной инфекции респираторного тракта и ЛОР-органов); снижение чувствительности к стандартной антибактериальной терапии». Исследование получило одобрение локального этического комитета ФГБОУ ВО «КубГМУ» Министерства здравоохранения России.

Для подтверждения клинической эффективности применения фармацевтического препарата гексапептид в комплексной терапии детей с ОДП были проанализированы данные ретроспективного исследования показателей детей, получавших традиционное лечение – архивная группа для сравнения (n = 20, аГС).

Детям ГИ с ОДП с 1-х суток послеоперационного периода в комплексную терапию был включен фармпрепарат «Имунофан», с действующим веществом – аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин диацетат (гексапептид, фпГП). Препарат разрешен для использования у детей с 2 лет в комплексной терапии вторичных иммунодефицитных и токсических состояний. Применение фармпрепарата основывается на признанных и подтвержденных эффектах иммунорегуляции, включая влияние на количество и активность НГ, Т-лимфоцитов, а также уровень иммуноглобулинов [15]. Также следует отметить его детоксикационные и гепатопротективные свойства, а также способность к инактивации свободнорадикальных и перекисных соединений [4].

Оценка эффективности иммунотропной терапии фпГП до (ГИ) и после лечения (ГИ1) осуществлялась детекцией содержания НГ 2 субпопуляций, определяющих процессы активации микробицидных функций: CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺, плотности экспрессии (MFI) поверхностных мембранных рецепторов CD16 (FcγRIII), CD62L (L-селектин), CD11b (Mac-1, CR3A, CD63 (тетраспанин-3) (Cytometer FC 500, Beckman Coulter, США). Функции НГ тестировали по показателям фагоцитоза: %ФАН – доля активно фагоцитирующих НГ, ФЧ, ФИ отражающие способность захвата S. аureus, завершенность фагоцитоза – %П, ИП). В NBT-тесте (спонтанном и стимулированном S. aureus) определяли NADPH-оксидазную активность, по доле формазан-позитивных клеток (%ФПК) и среднему цитохимическому индексу (СЦИ).

Статистическая обработка проведена в программе IBM SPSS Statistic 20. Нормальность распределения данных в исследуемых выборочных совокупностях определена по критерию Шапиро–Уилка. Различия между независимыми выборками устанавливались по непараметрическому критерию Манна–Уитни. Результаты представлены медианой и квартильным диапазоном (Ме (Q_0,25-Q_0,75)). Статистически значимыми определены различия при p < 0,05. Для корректировки значения p с учетом множественных сравнений применялась поправка Холма–Бонферрони. Для определения размера эффекта рассчитывалось значение дельты Клиффа.

Результаты и обсуждение

Анализ иммунологических показателей детей ГИ выявил повышение общего количества лейкоцитов до 13,3 (9,9-16,0) × 10⁹/л относительно 6,3 (5,7-7,0) × 10⁹/л в ГС (р < 0,05), увеличение количества НГ до 56,0 (49,0-66,0) % и доли палочкоядерных форм (ПЯЛ) – 7,5 (4,0-9,5) %, относительно 44,3 (39,9-47,3) %, ПЯЛ – 2,0 (1,0-3,0) % в ГС (р_{1, 2} < 0,05).

Фенотипирование в ПК НГ детей ГС и ГИ выявило две субпопуляций НГ – CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ характеризующиеся разным уровнем экспрессии рецепторов по MFI.

Так, в ГС доля субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ составила 94,9 (93,5-96,8) %, а CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ – 3,5 (1,5-4,5) %. Данные субпопуляции имели схожую плотность экспрессии СD16 и CD11b рецепторов (р_{1, 2} > 0,05). Тем не менее субпопуляция CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺, экспрессирующая CD63 с плотностью по MFI 2,2 (1,7-3,2) характеризовалась более низким уровнем молекул CD62L – 4,5 (3,5-6,8) против 7,1 (6,4-9,3) (р > 0,05) (табл. 1).

 

Таблица 1. Соотношение и фенотип субпопуляций СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63^- и СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ нейтрофильных гранулоцитов детей с острой деструктивной пневмонией до и после лечения, Me (Q_0,25-Q_0,75)

Table 1. Ratio and phenotype of CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- and СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺C63⁺ neutrophil granulocytes subsets in children with acute destructive pneumonia before and after treatment, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Показатели Indicators	Группа сравнения Comparison group	Группа исследования до лечения, (ГИ) Study group before treatment (SG)	Группа исследования после лечения, (ГИ1) Study group after treatment (SG1)
СD16+СD62L+CD11b+CD63-НГ СD16+СD62L+CD11b+CD63-NG
	CD16brightСD62LbrightCD11bmidCD63-	СD16dimСD62LdimCD11bbrightCD63-	CD16brightСD62LbrightCD11bmidCD63-
НГ, % NG, %	94,9 (93,5-96,8)	88,6 (83,5-91,0)*	94,2 (93,4-97,7)^
MFI СD16	129,5 (115,7-131,7)	83,4 (63,2-104,0) *	120 (91,7-193,0)
MFI CD62L	7,1 (6,4-9,3)	5,8 (4,5-6,2)*	11,4 (7,7-19,8)^
MFI CD11b	16,4 (9,6-20,9)	25,6 (21,6-34,7)*	26,5 (15,2-32,3)
СD16+СD62L+CD11b+CD63+НГ СD16+СD62L+CD11b+CD63+NG
	СD16brightСD62LbrightCD11bmidCD63dim	СD16brightСD62LbrightCD11bbrightCD63bright	СD16brightСD62LbrightCD11bbrightCD63dim
НГ, % NG, %	3,5 (1,5-4,5)	11,7 (6,6-14,6)*	3,1 (2,0-4,3)^
MFI СD16	127,0 (112,7-130,0)	124,5 (65,5-153,2)	104,9 (47,5-175,8)
MFI CD62L	4,5 (3,5-6,8)	7,5 (7,3-11,0)*	6,7 (6,8-17,4)
MFI CD11b	15,4 (14,9-15,9)	26,5 (16,6-32,8)*	24,6 (17,7-35,2)*
MFI CD63	2,2 (1,7-3,2)	3,6 (3,4-4,9)*	3,0 (2,2-3,3)*

Примечание. * – различия показателей ГИ и ГИ1 относительно ГС, p < 0,05; ^ – различия между показателями ГИ и ГИ1, p < 0,05.

Note. *, differences in indicators of the study groups with acute destructive pneumonia relativity from the indicators of conditionally healthy children, p < 0.05; ^, differences between study groups, p < 0.05.

 

В ГИ при ОДП отмечено снижение в ПК количества НГ субпопуляции СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63^- до 88,6 (83,5-91,0) % (р < 0,05) относительно ГС и изменение их фенотипа: уменьшение плотности экспрессии CD16 – 83,4 (63,2-104,0) (р < 0,05) и CD62L до 5,8 (4,5-6,2) (р < 0,05) и повышение MFI CD11b (р < 0,05) относительно ГС. Такая трансформация фенотипа НГ из CD16^brightСD62L^brightCD11b^midCD63^-НГ, который характерен для функционально-зрелых клеток на СD16^dimСD62L^dimCD11b^brightCD63^-, описанный в литературе для НГ с неполноценными иммунными свойствами [9, 10]. Помимо этого, установлено, что содержание НГ субпопуляции СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ увеличилось в 3 раза относительно ГС (р < 0,05). Субпопуляции характеризоваиась активированным фенотипом – СD16^brightСD62L^brightCD11b^brightCD63^bright, что связано с повышенной плотностью экспрессии рецепторов – CD11b (в 1,7 раза, р < 0,05) и CD63 (в 1,6 раза, р < 0,05).

Изменение содержания, а также перераспределение соотношения исследуемых субпопуляций НГ и изменение их фенотипов сопровождалось снижением их фагоцитарной активности. Было установлено неадекватное для тяжелого воспалительного процесса при ОДП повышение %ФАН до 59,0 (50,0-64,0) % относительно показателей в ГС (55,8 (54,8-58,8) %, р > 0,05), снижение значений ФЧ – 2,8 (2,6-2,9) относительно 4,0 (3,7-4,3) (р < 0,05) и ФИ 1,8 (1,4-1,9) относительно 2,5 (1,8-3,3) в ГС (р > 0,05), отражающих процессы захвата, а также переваривающей способности: %П – 44,2 (39,4-49,0) % относительно 60,0 (57,9-62,9) % и ИП – 0,8 (0,6-0,9) относительно 1,3 (1,2-1,4) в ГС (p_{1, 2} < 0,05). Вместе с тем в ГИ регистрировалось повышение NADPH-оксидазной активности как в NBT спонтанном, так и в NBT стимулированном тесте (%ФПКсп – 6,0 (5,5-14,0) % относительно 3,5 (3,0-4,0) % в ГС, СЦИсп – 0,15 (0,1-0,3) относительно 0,07 (0,01-0,08) в ГС; р_{1, 2} < 0,05); %ФПКст – 15,5 (7,0-19,9) % относительно 4,5 (4,0-8,0) % в ГС, СЦИст – 0,6 (0,22-1,0) относительно 0,17 (0,1- 0,2) в ГС) (р₁ < 0,05, р₂ > 0,05).

Учитывая установленные дефекты НГ, касающиеся изменений фенотипа исследуемых субпопуляций, а также их количественного содержания и соотношения, сопровождающиеся снижением миграции НГ в очаг воспаления, адгезивных и фагоцитарных функций и, напротив, усилением активации NADPH-оксидазной активности, была предложена программа иммуномодулирующей терапии с включением фпГП (рис. 1).

 

Рисунок 1. Программа комплексной терапии в лечении детей 2-4 лет с острыми деструктивными пневмониями

Figure 1. Complex therapy program for the treatment of children 2-4 years old with acute destructive pneumonia

 

В до- и послеоперационный период детям с ОДП назначалось комплексное лечение, которое обязательно включало эмпирическую антибактериальную терапию на начальном этапе, с дальнейшей корректировкой курса в соответствии с чувствительностью определенного возбудителя, объемную сопроводительную поддержку (рис. 1).

После лечения (ГИ1) выявлено увеличение содержания НГ субпопуляции СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63^- до 94,2 (93,4- 97,7) % относительно 88,6 (83,5-91,0) до лечения (р < 0,05). В данной субпопуляции наблюдалось увеличение плотности экспрессии CD16 и CD62L (р_{1, 2} < 0,05) до значений ГС и снижение MFI CD11b (р > 0,05) (табл. 1), что отражает фенотип – CD16^brightСD62L^brightCD11b^midCD63^-НГ. Кроме того, наблюдалось снижение уровня НГ субпопуляции СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ в 3,8 раза по сравнению с показателями до начала лечения (р < 0,05), а также изменение фенотипа на СD16^brightСD62L^brightCD11b^brightCD63^dim. В данной субпопуляции выявлено снижение MFI молекул CD63 до показателей ГС (р_{1, 2} < 0,05), в то время как MFI рецепторов СD62L и CD11b сохранялись на значениях, предшествующих лечению. Выявленная реконструкция рецепторного аппарата НГ способствовала восстановлению эффекторного функционального потенциала НГ.

В ГИ1 в результате проведенной иммунотерапии отмечалось повышение фагоцитарной и микробицидной активности НГ. Отмечено повышение киллинговой и переваривающей активности НГ: %П – 55,3 (50,8-54,7) % относительно 44,2 (39,4-49,0) % до лечения и ИП 1,3 (1,0-1,2) относительно 0,8 (0,6-0,9) до лечения (p_{1, 2} < 0,05), усиление процессов захвата ФЧ – 3,1 (3,0-3,7) (р < 0,05); ФИ – 2,0 (1,7-2,3) (р > 0,05) в сравнении с данными до лечения, при не меняющемся %ФАН (р > 0,05). Кроме того, происходит восстановление баланса NADPH-оксидаз в спонтанном и стимулированном NBT-тесте. Отмечалось снижение показателей %ФПКсп и СЦИ сп (р_{1, 2} < 0,05) до значений ГС, %ФПКст и СЦИст (р_{1, 2} > 0,05), до уровня, свидетельствующего о сохранении резервного микробицидного потенциала КМ – 4,1 (4,05-5,3).

Позитивные изменения иммунологических показателей, характеризующих восстановление функционирования НГ, сопровождались выраженными клиническими эффектами.

Анализ эффективности использования иммуномодулирующей терапии фпГП в комплексном лечении детей 2-4 лет с ОДП выявил значимые положительные эффекты. Так, в группе пациентов, получавших в комплексной терапии фпГП, было выявлено статистически значимое снижение длительности лихорадки (p = 0,00000591, |δ| = 0,98 (ДИ: 0,96-1,00)), дыхательной недостаточности (p = 0,00000572, |δ| = 0,99 (ДИ: 0,97-1,00)), наличия гнойного плеврального выпота (p = 0,00000591, |δ| = 0,96 (ДИ: 0,91-1,00)) и дренирования (p = 0,00000591, |δ| = 1,00 (ДИ: 1,00- 1,00)) относительно группы пациентов, получавших стандартное лечение, что свидетельствует о выраженной клинической эффективности использования фпГП в комплексном лечении в послеоперационном периоде (рис. 2).

 

Рисунок 2. Клиническая эффективность иммуномодулирующей терапии у детей 2-4 лет с острой деструктивной пневмонией

Figure 2. Clinical efficacy of immunomodulatory therapy in children aged 2-4 years with acute destructive pneumonia

 

На основе обобщения и анализа полученных данных было установлено наличие статистически значимых положительных клинико-иммунологических эффектов, ассоциированных с включением фармпрепарата гексапептида в программу комплексной терапии детей с ОДП, что подтверждает целесообразность данного подхода.

Выводы

1. В результате исследования у детей с ОДП выделены две субпопуляции НГ: CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺.
2. Выявлена трансформация фенотипа НГ, характеризующего зрелые функционально-полноценные клетки, CD16^brightСD62L^brightCD11b^midCD63^- на СD16^dimСD62L^dimCD11b^brightCD63^-, которая обладает неполноценными иммунными свойствами, а также показано значительное увеличение содержания гиперактивированной субпопуляции НГ с фенотипом CD16^brightCD62L^brightCD11b^brightCD63^dim, обладающей высоким цитотоксическим и протеолитическим потенциалом и способностью повреждать ткани при ОДП.
3. Определение повышенного уровня гиперактивированной субпопуляции НГ в периферической крови детей с ОДП, имеющих фенотип CD16^brightCD62L^brightCD11b^brightCD63^dim c высоким цитотоксическим и протеолитическим потенциалом и способностью повреждать легочную ткань, имеет важное значение, поскольку сопряжено с тяжестью гнойно-воспалительного процесса.
4. Включение иммунотропной терапии препаратом «Имунофан» демонстрирует эффект реконструктивного иммуномодулирования изучаемых субпопуляций НГ: повышение количества и нормализацию фенотипа субпопуляции CD16^brightСD62L^brightCD11b^midCD63^- и регрессию количества и активности фенотипа субпопуляции CD16^brightCD62L^brightCD11b^brightCD63^dim, а также восстановление их эффекторной функции.
5. На фоне восстановления баланса количественного соотношения и фенотипов изучаемых субпопуляции наблюдается выраженная позитивная клиническая динамика: снижение длительности лихорадки, дыхательной недостаточности, более быстрое уменьшение объема гнойного плеврального выпота и длительности дренирования относительно группы пациентов, получавших стандартное лечение, что свидетельствует о выраженной клинической эффективности использования фпГП в комплексном лечении ОДП в послеоперационном периоде.

About the authors

Irina V. Nesterova

Kuban State Medical University; P. Lumumba Peoples’ Friendship University of Russia

Author for correspondence.
Email: inesterova1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6071-4409

PhD, MD (Medicine), Professor, Chief Researcher, Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Scientific Research Laboratory, Professor, Department of Clinical Immunology, Allergology and Adaptology, Faculty of Continuing Medical Education, Medical Institute

Russian Federation, Krasnodar; 6 Miklouho-Maclay St, Moscow, 117198

Galina A. Chudilova

Kuban State Medical University

Email: chudilova2015@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8005-9325

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head of the Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Research Laboratory, Professor of the Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Krasnodar

Anastasia D. Safontseva

Kuban State Medical University

Email: ensmorbi@gmail.com
ORCID iD: 0009-0001-8972-056X

Postgraduate Student, Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Krasnodar

Valeriya N. Chapurina

Kuban State Medical University

Email: Pavlenkoevi2016@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1912-2038

PhD (Medicine), Assistant Professor of the Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics, Researcher of the Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Scientific Research Laboratory

Russian Federation, Krasnodar

Darina E. Lyagusha

Children’s Regional Clinical Hospital

Email: darina_hapacheva@mail.ru
ORCID iD: 0009-0005-2919-4923

Pediatrician, Surgical Department No. 1

Russian Federation, Krasnodar

Natusya K. Barova

Kuban State Medical University; Children’s Regional Clinical Hospital

Email: nbarova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5857-2296

PhD (Medicine), Associate Professor, Head, Department of Surgical Diseases of Childhood, Head, Surgical Department No. 1

Russian Federation, Krasnodar; Krasnodar

References

Supplementary files