Spontaneous cytokine production by the cells from peripheral blood, lymph nodes, spleen, thymus and skin in a murine model of acute psoriasis-like dermatitis

Full Text

Введение

Для исследования патогенетических механизмов развития псориаза и изучения новых терапевтических средств успешно применяется мышиная имиквимод-индуцированная модель псориаза [2, 12, 14]. Многочисленными исследованиями установлено, что псориаз относится к аутоиммунным заболеваниям, и в его течении важное участие принимают клеточные механизмы [6, 7, 8]. Поэтому получение сведений о субпопуляционном составе клеток крови и способности их продуцировать широкий спектр цитокинов (провоспалительных, противовоспалительных, регуляторных) на разных стадиях патологического процесса несет важную информацию для иммунологов и дерматологов [5, 7, 9]. Применение имиквимод-индуцированной модели псориаза дает исследователям дополнительные возможности в виде изучения продукции цитокинов не только клетками крови, но и клетками, выделенными из кожи, а также селезенки, лимфатических узлов и тимуса. При изучении опубликованных работ по данной теме нами встречались разрозненные данные по продукции отдельных цитокинов, клетками, выделенными из отдельных органов. Нами была поставлена задача комплексно изучить цитокиновые профили клеток не только крови, но и центральных и периферических лимфоидных органов экспериментальных животных.

Материалы и методы

Исследование проводилось на самках мышей линии C57BL/6, массой 18-20 г, полученных из питомника «Столбовая» Московской области. Животные были ранжированы путем случайного распределения на 2 группы. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. Опытная и контрольная группы животных содержались в соответствии с этическим требованиям фармакологического комитета (1999). На мышах группы 1 (опытная, n = 24) воспроизводили модель псориазоподобного дерматита с помощью индуктора патологии (имиквимод); группа 2, контрольная, (n = 22), не получала препаратов. За один день до начала исследования всем животным удаляли шерсть площадью примерно равной 6 см² (2 × 3 см) с помощью гипоаллергенного эпилирующего крема. Формирование экспериментальной патологии было проведено по методу L. van der Fits и соавт. (2009) [15], с дозой индуктора патологии (крем, содержащий 5%-ный имиквимод) 62,5 мг/см² в день на животное (ежедневная доза 3,125 мг активного соединения) в течение 7 дней. Кровь для иммунологических исследований отбирали в пробирки с гепарином в объеме 200 мкл на 7-й день исследования. У лабораторных животных извлекали селезенку, лимфатические узлы (подмышечные, паховые), тимус, а также получали биоптат кожи размерами 2 × 2 см (в месте формирования патологии, у здоровых мышей – в этой же локализации). Для изоляции клеток из кожи применяли метод спонтанной миграции [13].

Определение концентрации свободных цитокинов в супернатантах мононуклеарных лейкоцитов (МНЛ) периферической крови, селезенки, лимфоузлов, тимуса и кожи мышей

Культуру МНЛ периферической крови, селезенки, лимфатических узлов, тимуса, кожи инкубировали 24 часа в ростовой среде RPMI-1640, затем исследовали спонтанную продукцию цитокинов в супернатантах МНЛ. Уровень цитокинов определяли при помощи тест-системы Mouse Th1/Th2/Th17 Panel (Antigenix America, каталожный номер MMX171, США) с использованием шариков, сенсибилизированных моноклональными антителами к цитокинам: IFNγ (интерферон гамма), IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, TNFα (фактор некроза опухоли альфа), IL-10. Уровень цитокинов определяли согласно инструкции производителя с использованием проточного цитометра FC-500 (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку материала проводили при помощи программного пакета WINMDI 2.8.

Результаты

При изучении спонтанной продукции отдельных цитокинов в супернатантах культур клеток, взятых из разных биолокусов, выявлены следующие особенности.

От мышей были получены кожные биоптаты, которые дезинтегрировали с получением отдельных клеток. Данные о цитокинах, продуцирумых клетками, изолированными из кожи, приведены в таблице 1. В процессе культивирования, МНЛ, выделенные из воспаленного очага, продуцировали повышенные уровни таких цитокинов, как IL- 1A (повышение в 3,1 раза), IL-17 (в 2,4 раза), IL-5 (в 2,1 раза), IFNγ (в 1,3 раза). Содержание IL- 6, TNFα и IL-10 было сопоставимо с контрольной группой. Так как продукция IL-10 достоверно не повышалась, баланс провоспалительных/противовоспалительных цитокинов был сдвинут в сторону преобладания воспалительных процессов. В связи с этим местное воспаление кожных покровов перерастало в системное.

 

ТАБЛИЦА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПОНТАННОЙ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ В СУПЕРНАТАНТАХ КУЛЬТУР КЛЕТОК, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ КОЖИ МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6 (М±σ), пкг/мл

TABLE 1. DETERMINATION OF SPONTANEOUS CYTOKINE PRODUCTION IN CELL CULTURE SUPERNATANTS ISOLATED FROM THE SKIN OF C57BL/6 MICE (М±σ), pg/mL

Продукция цитокинов Cytokine production	IFNγ	IL-6	IL-5	IL-17A	IL-1A	TNFα	IL-10
Имиквимод IMQ	261,6±9,0*	46,5±4,6	121,5±64,5*	286,9±8,5*	195,6±8,8*	182,8±10,5	19,0±2,7
Контроль Control	204,8±16,3	49,0±4,1	59,9±6,6	116,6±9,7	62,8±6,2	172,4±7,9	15,2±4,8

Примечание. М – средняя арифметическая; σ – стандартное отклонение; * p < 0,05 – достоверность различий между группами мышей (Mann–Whitney U test).

Note. M, the arithmetic mean; σ, the standard deviation; * p < 0.05, the reliability of differences between groups of mice (Mann–Whitney U test).

 

Оценивая спонтанную продукцию цитокинов в супернатантах мононуклеаров периферической крови мышей (табл. 2), обращает на себя внимание, что у мышей с острым воспалением достоверно повышенными оказались почти все изучаемые цитокины (за исключением TNFα). Более всего была повышена продукция IL-1A (201,8±20,0 по сравнению с контролем 22,0±3,5) – в 9,1 раза; IL-6 (72,0±10,3 по сравнению с контролем 20,9±2,6) – повышение концентрации в 3,6 раза, IL-5 (164,8±13,1 по сравнению с контролем 51,6±6,6) – повышение в 3,2 раза, IL-17A (228,2±9,2 по сравнению с контролем 101,1±8,1) – выше в 2,3 раза по сравнению с контрольными мышами.

 

ТАБЛИЦА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПОНТАННОЙ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ В СУПЕРНАТАНТАХ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6 (М±σ), пкг/мл

TABLE 2. DETERMINATION OF SPONTANEOUS CYTOKINE PRODUCTION IN THE SUPERNATANTS OF MONONUCLEAR CELLS ISOLATED FROM THE PERIPHERAL BLOOD OF C57BL/6 MICE (М±σ), pg/mL

Продукция цитокинов Cytokine production	IFNγ	IL-6	IL-5	IL-17A	IL-1A	TNFα	IL-10
Имиквимод IMQ	261,3±12,7*	72,2±10,3*	164,8±13,1*	228,2±9,2*	201,8±20,0*	195,2±15,6	26,8±4,4*
Контроль Control	172,7±7,2	20,8±2,9	51,6±6,6	101,1±8,1	22,0±3,5#	181,1±8,3	17,7±4,1

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

Спонтанная продукция цитокинов в супернатантах клеток, выделенных из лимфоузлов мышей (табл. 3), характеризуется несколько меньшей интенсивностью по сравнению с клетками крови. Однако и в этом исследуемом биоматериале были выявлены достоверные изменения. Максимально повышенным – в 1,9 раза, оказался синтез IL-1A (152,6±9,6 против 79,1±5,8), затем IFNγ в 1,6 раза (268,0±10,7 против 167,0±4,5). Уровень IL-6, IL-5 и IL-17 был выше по сравнению с интактными мышами в 1,3-1,2 раза. Продукция TNFα и IL-10 была сопоставима со значениями контрольной группы.

 

ТАБЛИЦА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПОНТАННОЙ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ В СУПЕРНАТАНТАХ КЛЕТОК, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6 (М±σ), пкг/мл

Table 3. Determination of spontaneous cytokine production in cell supernatants isolated from lymph nodes of C57BL/6 mice (М±σ), pg/mL

Продукция цитокинов Cytokine production	IFNγ	IL-6	IL-5	IL-17A	IL-1A	TNFα	IL-10
Имиквимод IMQ	268,0±10,7*	83,1±8,4	146,5±8,9*	171,7±10,9*	152,6±9,6*	183,7±12,1	24,5±4,5
Контроль Control	226,6±6,1	81,6±5,3	147,1±6,1	137,3±5,9	13,2±3,5	188,2±12,1	24,0±4,1

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

Спонтанная продукция цитокинов в супернатантах спленоцитов носит разнонаправленный характер (табл. 4). Уровень двух цитокинов – IL-1A (214,8±10,6 против 13,2±3,5) и IL-17A (209,9±11,5 против 137,9±5,9) был повышен по сравнению с контрольной группой в 16,1 и 1,5 раза. В то же время продукция IL-6 (76,8±4,7 против 108,4±10,6) и IFNγ (257,4±9,7 против 356,6±6,9) была ниже, чем в супернатантах МНЛ селезенок контрольных мышей. Значения концентраций IL-5, TNFα и IL-10 были сопоставимы с контрольной группой.

 

ТАБЛИЦА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПОНТАННОЙ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ В СУПЕРНАТАНТАХ КУЛЬТУР КЛЕТОК, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6 (М±σ), пкг/мл

TABLE 4. DETERMINATION OF SPONTANEOUS CYTOKINE PRODUCTION IN CELL CULTURE SUPERNATANTS ISOLATED FROM THE SPLEEN OF C57BL/6 MICE (М±σ), pg/mL

Продукция цитокинов в супернатантах клеток селезенки Cytokine production in the supernatants of spleen cells	IFNγ	IL-6	IL-5	IL-17A	IL-1A	TNFα	IL-10
Имиквимод IMQ	257,4±9,7*	76,8±4,7*	169,2±7,5	209,9±11,5*	214,8±10,6*	195,9±11,9	22,9±3,5
Контроль Control	356,6±6,9	108,4±10,6	163,6±7,5	137,9±5,9	13,2±3,5	188,2±12,1	24,02±4,1

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

При анализе цитокинов, продуцируемых культурами клеток, выделенных из тимуса (табл. 5), в группе воспроизводимой модели воспаления по сравнению с контролем было выявлено угнетение продукции части цитокинов – IL-6 (99,0±28,0 против 460,3±52,6), IFNγ (267,0±47,0 против 517,1±70,4), IL-5 (157,0±12,0 против 291,9±28,9), IL-10 (24,0±5,0 против 39,7±5,1) в 4,6, 1,9, 1,9 и 1,6 раза соответственно. Однако уровень IL-1A (266,0±31,0 против 194,5±23,9) был выше в 1,4 раза по сравнению с контролем. Уровень продукции IL-10 был схожим в сравниваемых группах.

 

ТАБЛИЦА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПОНТАННОЙ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ В СУПЕРНАТАНТАХ КУЛЬТУР КЛЕТОК, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ ТИМУСА МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6 (М±σ), пкг/мл

TABLE 5. DETERMINATION OF SPONTANEOUS CYTOKINE PRODUCTION IN CELL CULTURE SUPERNATANTS ISOLATED FROM THE THYMUS OF C57BL/6 MICE (М±σ), pg/mL

Продукция цитокинов Cytokine production	IFNγ	IL-6	IL-5	IL-17A	IL-1A	TNFα	IL-10
Имиквимод IMQ	310,1±8,6*	124,9±6,4*	165,6±9,1*	202,4±8,7*	295,1±7,9*	196,9±8,9*	25,9±4,1
Контроль Control	667,3±11,4	304,1±7,6	116,4±8,2	137,1±6,2	198,8±6,3	23,12±4,50	25,7±5,7

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

Мониторинг концентрации цитокинов показал изменение уровня провоспалительных цитокинов (IL-1α, IL-6, IL-17, IFNγ), продукция противовоспалительного цитокина IL-10 была повышена только в супернатантах культуры МНЛ крови.

Обсуждение

Имиквимод, нанесенный на интактную кожу, путем связывния с TLR 7-го типа на дендритных клетках, в частности клетках Лангерганса, непосредственно вмешиваясь в процесс цитокиновой регуляции и запуская выраженную гиперпродукция целого ряда провоспалительных цитокинов, запускает патологический процесс [1, 10, 11]. Как видно из представленных данных, несмотря на то, что индуктор патологии – имиквимод поступал в организм мышей через кожу, его введение оказало системное воздействие – воспалительная реакция не ограничилась кожными покровами, а протекала в центральных и периферических иммунных органах.

Сравнивая спонтанную продукцию цитокинов в супенатантах клеток, выделенных из разных биолокусов, обращает на себя внимание, что максимально заметные изменения в интенсивности синтеза медиаторов иммунного ответа наблюдаются в крови мышей.

Наиболее выраженная реакция на поступление имиквимода в организм мышей наблюдался в отношении провоспалительного цитокина интерлейкина-1. Анализируя спонтанную продукция этого цитокина у интактных мышей, видно, что в отсутствие воздействия индуктора патологии (имиквимода) у мышей наблюдается некий базовый уровень синтеза IL-1 (13-22 пкг), при этом в коже и тимусе синтез данного цитокина протекает более интенсивно (62 и 198 пкг), что можно объяснить тем, что даже здоровая кожа испытывает значительное антигенное воздействие. У мышей опытной группы, обработанных имиквимодом, в культурах клеток из всех изучаемых биолокусов наблюдалось повышенное накопление IL-1 в супернатантах. В крови, лимфоузлах и селезенке оно было очень выраженным. Наибольший рост концентрации IL-1 (16-кратный) был выявлен в супернатантах селезенки, а в коже и тимусе он был менее интенсивным, что связано с изначально более высокими концентрациями этого цитокина у интактных мышей.

Интересными были полученные данные по содержанию IL-6. У интактных мышей спонтанная продукция данного провоспалительного цитокина в отсутствие стимуляции имиквимодом была довольно значительной в культуре МНЛ крови, тимуса (304 пкг), а в культурах МНЛ селезенки, кожи и лимфоузлов синтез протекал менее интенсивно (108, 49 пкг). А в процессе воспроизведения модели острого псориатического воспаления наблюдалось угнетение синтеза данного цитокина в культурах МНЛ крови, тимуса и селезенки в 2,4 и 1,4 раза, а в культурах МНЛ лимфоузлов и кожи продукция IL-6 не различалось у мышей контрольной и экспериментальной групп.

Спонтанная продукция IL-17 у мышей контрольной группы находилась приблизительно на одном уровне во всех исследуемых биолокусах и колебалась в пределах 101,0-137,0 пкг. По современным представлениям, IL-17A вызывает пролиферацию кератиноцитов и является одним из главных эффекторов при псориазе [3, 4]. При воздействии имиквимода на организм мышей наблюдалось усиление продукции данного провоспалительного цитокина в 1,2-2,4 раза, наиболее ощутимое в культуре МНЛ крови и кожи (в 2,2 и 2,4 раза).

Продукция TNFα в культуре МНЛ тимуса была незначительной и составляла 23 пкг, в то время как в культивируемых МНЛ из остальных биолокусов продукция была более интенсивной и варьировала в пределах от 172 пкг до 188 пкг. Имиквимод оказал свое воздействие на интенсивность продукции фактора некроза опухоли α только в культуре МНЛ тимуса, где наблюдалось усиление продукции в 8,5 раза, а в остальных исследуемых биолокусах не наблюдалось изменения продукции данного цитокина.

Культура МНЛ крови и кожи интактных мышей продуцировала в культуральную жидкость незначительные количества IL-5 (51 и 59 пкг), уровень продукции в культурах клеток из других биолокусов был более высоким в диапазоне от 116 пкг до 169 пкг. Под влиянием имиквимода синтез IL-5 усиливался в 1,4-3,2 раза в культурах МНЛ тимуса, кожи и крови, а в культурах МНЛ лимфоузлов и селезенки изменений продукции не наблюдалось.

Спонтанная продукция регуляторного цитокина IFNγ была достаточно интенсивной у мышей контрольной группы, особенно высоким этот синтез был в культуре МНЛ тимуса. Влияние имиквимода на продукцию IFNγ было разнонаправленным – в культуральных жидкостях селезенки и тимуса наблюдалось подавление синтеза цитокина в 1,4-2,1 раза, а в супернатантах МНЛ крови, лимфоузлов и кожи была замечена незначительная активизация продукции в 1,2-1,5 раза.

Заключение

Проведенное исследование свидетельствует о том, что при воспроизведении первичного имиквимод-индуцированного воспаления кожи мышей линии C57BL/6, клетки, выделенные из крови и других лимфоидных органов в процессе культивирования, синтезируют повышенные количества цитокинов, обладающих провоспалительным потенциалом. в первую очередь, IL-1 и IL-17, а также IFNγ, IL-6, которые поддерживают псориазоподобное воспаление. При этом роста продукции противоспалительного цитокина – IL-10 не наблюдалось (кроме супернатантов МНЛ крови), что способствовало прогрессированию воспалительной реакции.

About the authors

Ekaterina V. Sorokina

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Аcademy of Postgraduate Training FMBA

Author for correspondence.
Email: sorokina-cathrine@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1188-6578
SPIN-code: 1052-6474

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Laboratory of Mechanisms of Regulation of Immunity, I.Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Professor, Department of Dermatovenereology and Cosmetology, Academy of Postgraduate Education of the Federal State Budgetary Institution "Federal Scientific and Clinical Center for Specialized Types of Medical Care and Medical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency" of Russia

Russian Federation, Moscow; Moscow

E. A. Akhmatova

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: ela.150@yandex.ru

Junior Research Associate, Laboratory of Therapeutic Vaccines

Russian Federation, Moscow

V. N. Stolpnikova

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: stolpnikova@yandex.ru

PhD (Biology), Leading Research Associate, Laboratory of Mechanisms of Regulation of Immunity

Russian Federation, Moscow

E. O. Kalinichenko

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: gladius.domini@gmail.com

PhD (Medicine), Research Associate, Laboratory of Mechanisms of Regulation of Immunity

Russian Federation, Moscow

I. V. Bisheva

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: ibisheva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8143-7356
SPIN-code: 9846-1006

Research Associate, Laboratory of Mechanisms of Regulation of Immunity

Russian Federation, Moscow

S. A. Skhodova

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: skhodova2009@yandex.ru

PhD (Biology), Leading Research Associate, Laboratory of Mechanisms of Regulation of Immunity

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files