Phenotypic and functional characteristics of early thymic cells migrating to peripheral blood under normal conditions and in autoimmune disorders

Full Text

Введение

Развитие Т-лимфоцитов осуществляется в несколько этапов, важнейшим из которых является формирование аутотолерантности Т-клеток в тимусе. Наиболее ранними и антигенно наивными Т-клетками, выходящими из тимуса и фенотипически определяемыми в периферической крови у человека, являются «ранние тимические мигранты» (Recent Thymus Emigrant, RTE). Являясь источником RTE, тимус обеспечивает питательную среду для дифференцировки и селекции Т-клеток [5]. Взаимодействуя с клетками тимуса в процессе положительного и отрицательного отбора развивающийся репертуар Т-клеток (αβTCR) должен гарантировать функциональность и аутотолерантность Т-клеток, экспортируемых на периферию [5]. Большая часть выживших одиночных позитивных (SP single positive) тимоцитов (CD4⁺ или CD8⁺), прошедших контрольную точку отрицательного отбора, завершают свое интратимическое развитие и эмигрируют из тимуса в виде наивных CD4⁺ или CD8⁺ αβT-клеток (RTE) [3, 8]. Основные субпопуляции Т-клеток, которые генерируются в тимусе, представляют собой обычные (Tconv) αβТ-клетки, каждая из которых наделена потенциалом экспрессировать Т-клеточный рецептор (TCR) определенной специфичности. Помимо генерации наивных αβT-клеток мозговое вещество тимуса способствует образованию натуральных CD4⁺FoxP3⁺ наивных Т-регуляторных клеток (Treg). Развитие тимических Treg обусловлено взаимодействием αβTCR с собственным пептидом/MHC с аффинностью выше, чем у положительно отобранных обычных наивных SP-тимоцитов, но ниже порога отрицательного отбора. Тreg-клетки опосредуют установление и поддержание иммунологической аутотолерантности и Т-клеточного гомеостаза у людей [7]. Предполагается, что усиление толерантности Т-клеток посредством негативного отбора скорее всего не является абсолютным, поскольку аутореактивные клоны Т-клеток способны уклоняться от интратимической делеции и проникать в периферический репертуар [7, 8]. В предотвращении аутореактивных процессов, являющихся результатом функционирования аутореактивных Т-эффекторных клеток на периферии, роль Treg доминантна, о чем свидетельствуют аутоиммунные дефекты, возникающие при отсутствии Treg как у людей, так и у мышей [13, 14]. RTE связывают продукцию тимуса и пул рециркулирующих Т-клеток, поддерживая в достаточном количестве периферические Т-клетки, обеспечивает разнообразие их αβT-клеточных рецепторов, а также необходимое количество Treg, [2, 9, 10]. Нарушения функции тимуса, дисбаланс RTE и Treg были обнаружены как критические факторы патогенеза таких заболеваний, как диабет 1-го типа, рассеянный склероз, ювенильный идиопатический артрит, хроническая сердечная недостаточность, ВИЧ [15].

Таким образом, в тимусе формируется микроокружение, обеспечивающее образование и развитие наивных Т-лимфоцитов, а также этапы позитивной и негативной селекции. Правильное функционирование тимуса является важным фактором для снижения заболеваемости и смертности. Нарушение архитектуры тимуса, его клеточности, функциональной активности клеток, вызванное атрофией, дегенерацией, инволюцией, может приводить к снижению выхода наивных Т-клеток и ограниченному разнообразию TCR, нарушению образования Treg, а также к увеличению выхода аутореактивных Т-клеток, которое имеет большое значение для развития аутоиммунных заболеваний (АИЗ) [15]. Известно, что количественные и качественные изменения RTE наблюдаются при многих заболеваниях человека. Несмотря на потенциальное клиническое значение изменений RTE, точные связи между RTE и развитием АИЗ остаются плохо изученными и существует необходимость в таких исследованиях.

Целью настоящей работы являлась оценка соотношения недавно мигрировавших из тимуса клеток (RTE) и наивных Т-регуляторных клеток на периферии в норме и при аутоиммунной патологии.

Материалы и методы

Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из гепаринизированной периферической крови доноров и пациентов с ревматоидным артритом, псориазом и псориатическим артритом осуществляли методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (p = 1,077; ООО «ПанЭко», Москва). Выделенные МНК в количестве 1,5-2 млн фенотипировали методом многоцветной проточной цитометрии. Клетки периферической крови окрашивали конъюгированными с флуорохромами моноклональными антителами к поверхностным маркерам недавних тимичесих мигрантов (CD3, CD4, CD31 и CD45RA), Т-регуляторных клеток (CD4, CD25) в количестве рекомендуемом производителем в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. После чего клетки отмывали 1 мл растовора PBS c 0,02% EDTA и 0,5% FCS (Staining Buffer) при 1100 об/мин в течение 5 минут. Затем клетки фиксировали и пермиабилизировали набором буферов CytoFix/CytoPerm (BD, США) согласно инструкции производителя. Далее клетки окрашивали антителами к внутриклеточным маркерам Ki-67 и FoxP3 в течении 30 минут при комнатной температуре в темноте. После окрашивания клетки отмывали 1 mL 1xPerm/Wash при 300 g 5 минут. Анализ проб проводили в 210 мкл Staining Buffer. Использовались следующие панели: 1. CD31-PE/ Cy7 (Elabscience, США) и CD3-FITC, CD4-PE, CD45RA-APC/Cy7, CD25-PE/ Cy5, Ki-67-APC (BioLegend, США); 2. CD31-PE/Cy7 (Elabscience, США) и CD4-FITC, CD25-PE/ Cy5, CD45RA-APC/Cy7, FoxP3-PE, Ki-67-APC (BioLegend, США). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACS Canto II (BD, США) с использованием программного обеспечения FACS Diva 6.0 (BD, США) и на проточном цитофлуориметре LongCyte (Challenbio, Китай) в программном обеспечении ModelFlower (Challenbio, Китай). Число пролиферирующих клеток в субпопуляциях определяли как процент позитивных по маркеру Ki-67 клеток. Статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакета GraphPadPrism 9 (GraphPad, США). Согласно критерию Шапиро–Уилка распределение не соответствовало нормальному, поэтому применялись методы непараметрической статистики. Для сравнения несвязанных переменных использовали U-критерий Манна–Уитни. Для множественного сравнения групп применялся дисперсионный анализ с постериорным попарным сравнением для выявления отличающихся групп. Выявленные отличия считали достоверными при уровне значимости p < 0,05. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного размаха, возраст и данные опросников представлен в виде среднего и ошибки среднего.

Результаты и обсуждение

В исследование было включено 6 пациентов с ревматоидным артритом (РА), 8 пациентов с вульгарным псориазом (ПС), 6 пациентов с псориатическим артритом (ПсА) и 8 условно здоровых доноров. Характеристика лиц, включенных в исследование, представлена в таблице 1.

 

Таблица 1. Характеристика лиц, включенных в исследование

Table 1. Characteristics of individuals included in the study

	Доноры Donors (n = 8)	Псориаз Psoriasis (n = 8)	Псориатический артрит Psoriatic arthritis (n = 6)	Ревматоидный артрит Rheumatoid arthritis (n = 6)
Возраст, годы Age, years	41,4±3,1	44,4±5,4	55,3±5,1	40,3±1,9
Пол: м/ж (%) Gender: m/f	1/7 (12,5/87,5)	5/3 (62,5/37,5)	1/5 (16,7/83,3)	0/6 (0/100)
PASI	–	10,3±2,3	4,9±1,8	–
DAPSA	–	–	21,4±5,9	–
DAS28	–	–	–	3,47±0,63
CDAI	–	–	–	12,3±4,5

Примечание. Данные представлены: среднее ± ошибка среднего (M±m). CDAI – клинический индекс активности болезни; DAPSA – индекс активности псориатического артрита; DAS28 – индекс активности ревматоидного артрита по 28 суставам; PASI – индекс площади и тяжести псориаза.

Note. Data are presented as mean ± error of the mean (M±m). CDAI, Clinical Disease Activity Index; DAPSA, Disease Activity index for PSoriatic Arthritis; DAS28, Disease Activity Score 28; PASI, Psoriasis Area and Severity Index.

 

Пациенты с РА были с низкой, умеренной и высокой активностью заболевания согласно индексам DAS28 и CDAI. Пациенты с ПС имели преимущественно легкое течение псориаза в соответствии с индексом PASI, а пациенты с ПсА имели легкое течение псориаза и низкую, умеренную и высокую активность артрита в соответствии с индексами PASI и DAPSA. Сложности в исследовании ранних тимических мигрантов связаны с отсутствием специфичных исключительно для RTE биомаркеров, тем не менее на сегодняшний день выделены молекулы, позволяющие обнаружить эти клетки на периферии. После выхода из тимуса CD4⁺ RTE экспрессируют высокие уровни мембранного гликопротеина CD31 (PECAM-1) [12]. Истинно наивные CD4⁺CD31⁺ клетки имеют высокое содержание TRECs относительно центральных наивных Т-клеток (CD4⁺CD45RA⁺CD31^-), кроме того, частота данной популяции снижается с возрастом [4, 12]. Прямая зависимость между экспрессией CD31 и наличием эксцизионных колец T-клеточного рецептора в клетке, делает эту молекулу наиболее привлекательным в использовании маркером RTE, поскольку ПЦР, применяемая при определении непосредственно TREC, сопровождается разрушением клеток, что ограничивает параллельное окрашивание [4, 12]. Методом проточной цитофлуориметрии в периферической крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями и доноров без выявленной аутоиммунной патологии определяли относительное количество недавних тимических мигрантов CD4⁺CD45RA⁺CD31⁺. Анализ показал, что число недавних тимических мигрантов снижено в группе пациентов с РА и пациентов с ПсА относительно группы доноров. Число RTE в данных группах составило 17,3 (11,2-20,6) %, 18,6 (14,2-21,6) % против 23,6 (22,1-26,9) % p < 0,05 соответственно. За 100% было принято число клеток в гейте CD4⁺ лимфоцитов. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха. По числу ранних мигрантов группа пациентов с ПС статистически достоверно не отличалась от группы доноров и составила 14,7 (7,6-32,5) %. Далее мы выявляли долю FoxP3⁺Treg среди недавних тимических мигрантов (CD4⁺CD45RA⁺CD31⁺) для оценки соотношения RTE и наивных Treg. Достоверных отличий по содержанию FoxP3⁺Treg среди ранних тимических мигрантов CD4⁺CD45RA⁺CD31⁺ в периферической крови доноров (D) и пациентов с псориазом (Ps), псориатическим артритом (PSA), ревматоидным артритом (RA) между исследуемыми группами не было зафиксировано. При анализе за 100% было принято число клеток в гейте CD4⁺CD45RA⁺CD31⁺ лимфоцитов. Как известно, периферический пул Т-лимфоцитов в организме поддерживается 2 механизмами: образованием и выходом новых наивных Т-клеток из тимуса, а также гомеостатической пролиферацией наивных Т-клеток на периферии. Показано, что под действием IL-7 наивные Т-клетки способны пролиферировать с сохранением экспрессии CD31 и статуса наивных Т-лимфоцитов (1, 11). Кроме того, для РА описано, что гомеостатическая пролиферация вносит вклад в патогенез данного АИЗ. Поэтому мы оценили по экспрессии внутриклеточного белка Ki-67 число пролиферирующих клеток среди RTE и наивных FoxP3⁺Treg. Оказалось, что по уровню пролиферирующих клеток RTE-доноров и пациентов с ПС, ПсА РА достоверно не отличались друг от друга (табл. 2).

 

Таблица 2. Число пролиферирующих клеток среди CD4⁺CD45RA⁺CD31⁺ лимфоцитов и наивных FoxP3⁺treg в периферической крови доноров и пациентов с псориазом, псориатическим артритом, ревматоидным артритом.

Table 2. The number of proliferating cells among CD4⁺CD45RA⁺CD31⁺ lymphocytes and naive FoxP3⁺tregs in the peripheral blood of donors and patients with psoriasis, psoriatic arthritis, and rheumatoid arthritis.

Группа Group	Ki-67+RTE, %	Ki-67+Treg, %
Доноры Donors	2,6 (1,9-3,8)	2,5 (1,6-12,0)
Пациенты с псориазом Patients with psoriasis	2,4 (1,3-2,6)	8,6 (1,6-19,1)
Пациенты с псориатическим артритом Patients with psoriatic arthritis	2,0 (1,6-2,8)	4,5 (1,7-5,6)
Пациенты с ревматоидным артритом Patients with rheumatoid arthritis	3,1 (2,1-5,4)	15,8 (7,4-28,2)#

Примечание. ^# – достоверное отличие от числа пролиферирующих клеток среди CD4⁺CD45RA⁺CD31⁺ лимфоцитов пациентов с РА. За 100% принято число клеток в гейте CD4⁺CD45RA⁺CD31⁺ лимфоцитов (RTE) и число клеток в гейте CD4⁺CD45RA⁺CD31⁺FoxP3⁺ лимфоцитов (Treg). Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха.

Note. ^#, reliable difference from the number of proliferating cells among CD4⁺CD45RA⁺CD31⁺ lymphocytes of patients with RA. The number of cells in the gate of CD4⁺CD45RA⁺CD31⁺ lymphocytes (RTE) and the number of cells in the gate of CD4⁺CD45RA⁺CD31⁺FoxP3⁺ lymphocytes (Treg) are taken as 100%. Data are presented as median and interquartile range.

 

Число пролиферирующих наивных FoxP3⁺Treg у пациентов с псориатическими заболеваниями (ПС и ПсА) находилось на уровне донорских значений (табл. 2). Однако у пациентов с РА число пролиферирующих наивных FoxP3⁺Treg было достоверно выше числа пролиферирующих RTE (табл. 2), кроме того, оно имело тенденцию к увеличению по сравнению с числом пролиферирующих наивных FoxP3⁺Treg у доноров (p = 0,082).

Таким образом, при аутоиммунных заболеваниях, связанных с артропатией, происходит снижение относительного количества недавних мигрантов из тимуса, что может быть связано с уменьшением их относительного количества за счет возрастания активированных Т-лимфоцитов и доли центральных Т-клеток памяти, что было подтверждено нами ранее [6]. Число Тreg-клеток среди недавних мигрантов из тимуса и уровень их пролиферации у пациентов с псориатической патологией было сопоставимо с донорскими значениями, что говорит об отсутствии нарушений в генерации Т-регуляторных клеток в тимусе. При РА наблюдается усиление пролиферации наивных FoxP3⁺Treg на периферии, что может отражать нарушения в образовании Т-регуляторных клеток в тимусе и запуск компенсаторных механизмов для пополнения данной популяции. Как известно, в процессе пролиферации, индукции Treg на периферии утрачивается стабильность экспрессии FoxP3 и возрастает пластичность Treg, их способность переходить в патогенные популяции (exFoxP3), экспрессирующие провоспалительные цитокины. Для того чтобы сделать однозначные выводы при РА и открыть возможные перспективы для диагностических и терапевтических стратегий, необходимо увеличить группу пациентов.

Заключение

В исследовании установлено снижение RTE в группе пациентов с РА и ПсА, тогда как уровень RTE у пациентов с ПС достоверно не отличался от такового у доноров. Учитывая, что в группах пациентов с псориатическими заболеваниями (ПС и ПсА) доля наивных FoxP3⁺Treg среди RTE, а также число пролиферирующих клеток в периферической крови среди RTE и наивных FoxP3⁺Treg были сопоставимы с показателями доноров, можно сказать, что при псориатических заболеваниях отсутствуют изменения в процессе тимопоэза. Снижение RTE в данном случае может быть связано с активацией Т-клеток и увеличением числа центральных Т-клеток памяти в периферической крови. При РА изменения затрагивают не только RTE, но и число пролиферирующих наивных FoxP3⁺Treg, что предполагает нарушения в образовании Т-регуляторных клеток в тимусе и нуждается в дополнительном подтверждении на большей выборке пациентов.

About the authors

Tatiana Ya. Abramova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Author for correspondence.
Email: tatjana-abramova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6947-2212

PhD, MD (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Clinical Immunopathology

Russian Federation, 14 Yadrintsevskaya St, Novosibirsk, 630099

Olga S. Boeva

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: starchenkova97@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2720-0961

Postgraduate Student, Laboratory of Clinical Immunopathology

Russian Federation, 14 Yadrintsevskaya St, Novosibirsk, 630099

Olga A. Angelskaya

City Hospital No. 3

Email: anolga@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-7624-2279

Dermatovenerologist

Russian Federation, Novosibirsk

Vadim I. Borisevich

Novosibirsk State Medical University

Email: borvad2001@mail.ru
ORCID iD: 0009-0001-2731-6887

Student

Russian Federation, Novosibirs

Veronika S. Abbasova

Novosibirsk State Medical University

Email: abbasovaveronik@gmail.com
ORCID iD: 0009-0003-6038-4990

Student

Russian Federation, Novosibirsk

Maksim А. Korolev

Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology – Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: kormax@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-4890-0847

PhD, MD (Medicine), Rheumatologist, Head, Laboratory of Connective Tissue Pathology

Russian Federation, Novosibirsk

Vitaliy O. Omelchenko

Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology – Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: v.o.omelchenko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6606-7185

PhD (Medicine), Rheumatologist, Department of Rheumatology, Researcher, Laboratory of Connective Tissue Pathology

Russian Federation, Novosibirsk

Yuliya D. Kurochkina

Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology – Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: juli_k@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-7080-777X

PhD (Medicine), Rheumatologist, Department of Rheumatology, Researcher, Laboratory of Connective Tissue Pathology

Russian Federation, Novosibirsk

Anna D. Rybakova

Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology – Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: a.rybakova1@g.nsu.ru

Junior Researcher, Laboratory of Pharmacological Modeling dnd Screening of Bioactive Molecules

Russian Federation, Novosibirsk

Elena A. Blinova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: blinovaelena-85@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3327-3630

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Clinical Immunopathology

Russian Federation, 14 Yadrintsevskaya St, Novosibirsk, 630099

References

Supplementary files